تنقية البروتينات السطحية للبروتينات الخلية من<em> ريبيسفالوس ميكروبلوس</em> الخلايا الظهارية الظهارية
Summary
تم استخدام منهجية تعديل التدرج الطرد المركزي الكثافة المعدلة لعزل الخلايا الظهارية من الأنسجة ريفيسفالوس ميكروبلوس الأمعاء. والبروتينات سطح ملزمة كانت البيروكسيديز وتنقيته من خلال الخرز المغناطيسي ستريبتافيدين لاستخدامها في التطبيقات المصب.
Abstract
رابيسيفالوس ميكروبلوس – علامة الماشية – هو الطفيليات الخارجية الأكثر أهمية من حيث الأثر الاقتصادي على الثروة الحيوانية كمتجه لعدة مسببات الأمراض. وقد تم تكريس الجهود لمراقبة الماشية من أجل الحد من آثاره الضارة، مع التركيز على اكتشاف المرشحين اللقاح، مثل BM86، وتقع على سطح الخلايا الظهارية الأمعاء القراد. وتركز البحوث الحالية على استخدام كدنا والمكتبات الجينومية، للكشف عن المرشحين اللقاح الآخرين. عزل خلايا القناة الهضمية القراد يشكل ميزة هامة في التحقيق في تكوين البروتينات السطحية على غشاء الخلايا الهضمية القراد. هذه الورقة تشكل طريقة جديدة وقابلة للتنفيذ لعزل الخلايا الظهارية، من محتويات القناة الهضمية القراد من شبه محفور R. ميكروبلوس. يستخدم هذا البروتوكول تسيب و إدتا للافراج عن الخلايا الظهارية من الأنسجة دعم تحت الظهارية وتقطيع الكثافة الطرد المركزي المتقطعنت لفصل الخلايا الظهارية من أنواع الخلايا الأخرى. وكانت البروتينات السطحية الخلية البيروكسيديز ومعزولة من الخلايا الظهارية الأمعاء القراد، وذلك باستخدام الخرز المغناطيسي مرتبطة ستريبتافيدين السماح للتطبيقات المصب في فاكس أو لك-مس / MS- التحليل.
Introduction
و رابيسيفالوس ميكروبلوس ، علامة الماشية، هو الطفيليات الخارجية الأكثر أهمية من حيث الأثر الاقتصادي على صناعة الماشية في المناطق الاستوائية وشبه الاستوائية كما أنها تتجه حمى القراد البقري (بابيسيوسيس)، أنابلاسموسيس و بيروبلاسموسيس الخيول 1 ، 2 ، 3 ، 4 . وقد تم تكريس الجهود لمراقبة رقعة الماشية، لتقليل التأثير الضار، إلا أن الطرق التقليدية مثل استخدام مبيدات الكيماويات الكيميائية لها عيوب ضمنية، مثل وجود مخلفات كيميائية في الحليب واللحوم، والزيادة في انتشار القراد المقاوم كيميائيا 5 ، 6 ، 7 . ونتيجة لذلك، تم دراسة تطوير طرق بديلة لمراقبة القراد، مثل استخدام الماشية المقاومة الطبيعية، والمكافحة البيولوجية (المبيدات الحيوية) واللقاحاينيس 4 و 5 و 6 و 7 و 8 و 9 .
في السعي وراء البروتينات القادرة على استخدامها كمرشحين لقاح، وتركز البحوث الحالية على القناة الهضمية القراد. تم بناء جدار ميدغوت من طبقة واحدة من الخلايا الظهارية يستريح على الصفيحة القاعدية رقيقة، مع خارج الصفيحة القاعدية تشكيل شبكة من العضلات. وتشير الملاحظات المجهر الخفيفة والإلكترون أن ميدجوت يتكون من ثلاثة أنواع من الخلايا: الاحتياطي (غير متمايزة)، إفرازية، والجهاز الهضمي. يختلف عدد أنواع الخلايا اختلافا كبيرا تبعا للمرحلة الفسيولوجية. الخلايا الإفرازية والهضمية تنشأ من خلايا احتياطية 18 ، 19 ، 20 .
بناء مكتبات [كدنا]لفحص تكوين الأمعاء القراد أدى إلى تحديد البروتينات المستضدية، مثل Bm86، كما المرشحين المحتملين اللقاح 2 ، 3 ، 4 . ويترجم بروتين سكري Bm86 على سطح خلايا الأمعاء القراد ويحفز استجابة مناعية وقائية ضد القراد الماشية ( R. ميكروبلوس ) في الماشية تطعيم. المضادة لل Bm86 إيغس التي تنتجها المضيف تحصين يتم تناولها من قبل القراد، والتعرف على هذا المستضد على سطح خلايا القناة الهضمية القراد، وبعد ذلك يزعج وظيفة القناة الهضمية الأمعاء والنزاهة. وقد أظهرت اللقاحات التي تستند إلى مستضدات Bm86 السيطرة الفعالة على R. ميكروبلوس و ريبيسفالوس أنولاتوس، عن طريق الحد من عدد والوزن والقدرة الإنجابية للنساء الانخراط ، مما أدى إلى انخفاض الإصابة اليرقات في الأجيال القراد لاحق 4 . ومع ذلك، اللقاحات Bm86 مقرها ليست فعالة ضد جميع مراحل القراد ولهاأظهرت فعالية غير مرضية ضد بعض السلالات الجغرافية من R. ميكروبلوس ، وبالتالي فإن لحوم البقر ومنتجات الألبان اعتمدت بشكل سيء هذه اللقاحات 2 ، 4 .
القدرة على عزل الخلايا الظهارية من الأمعاء القراد هو ابتكار كبير من شأنه أن يتيح تطور البحوث لتحديد تكوين غشاء البروتين بما في ذلك التشكل وعلم وظائف الأعضاء في ظل ظروف بيئية مختلفة. الطريقة الموصوفة هنا تستخدم عامل خلات إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) و تريس عامل تخفيض (2-كاربوكسيثيل) فوسفين (تسيب) لاطلاق سراح الظهارة من الأنسجة دعم الظهارية الفرعية 10 . يتم استرداد ظهارة بعد انقطاع الميكانيكية من الأنسجة عن طريق الهز، تليها الطرد المركزي التدرج المتقطع في بيركول. هذه الورقة تصف تقنية مجدية ورائعة لعزل القراد الوراثي إيبيثيليال الخلايا. البروتينات السطحية الخلية البيروكسيديز، معزولة عن سطح هذه الخلايا الظهارية يمكن تحليلها لاحقا في التطبيقات المصب مثل فاكس و / أو لك-مس / MS- التحليل.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشكل إصابات القراد الماشية مشكلة رئيسية في صناعة الماشية في المناطق المدارية وشبه الاستوائية في العالم، حيث تعتمد الطريقة الأكثر شيوعا للسيطرة على استخدام مبيدات أكاريدس 1 ، 4 . تم تحديد Bm86 سابقا ضمن سطح الظهارة الأمعاء الظهارية كمست…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون أن يشكروا مستعمرة بيوسكوريتي تيك كولوني (إدارة ولاية كوينزلاند للزراعة ومصائد الأسماك في أستراليا) على توفير علامات ميكروبلوس ريبيسفالوس المستخدمة لهذه الدراسة، ولوكاس كاربانويتز للمساعدة في تصوير الفيديو.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. . Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. . "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , (1983).
