Rening av biotinylerade cellytaproteiner från<em> Rhipicephalus microplus</em> Epitelceller
Summary
En modifierad densitetscentrifugeringsgradientbaserad metod användes för att isolera epitelceller från Rhipicephalus microplus darmvävnad. Ytbundna proteiner biotinylerades och renades genom streptavidinmagnetiska pärlor för användning vid nedströmsapplikationer.
Abstract
Rhipicephalus microplus – boskapsskytten – är den mest betydande ektoparasiten när det gäller ekonomisk påverkan på boskap som vektor av flera patogener. Ansträngningar har ägnats åt boskapskontrollen för att minska dess skadliga effekter, med fokus på upptäckten av vaccinkandidater, såsom BM86, belägen på ytan av tarmkärlens epitelceller. Nuvarande forskning fokuserar på utnyttjandet av cDNA och genomiska bibliotek, för att screena för andra vaccinkandidater. Isoleringen av fästkärlceller utgör en viktig fördel vid undersökning av sammansättningen av ytproteiner på fästkammarmembranet. Detta papper utgör en ny och genomförbar metod för isolering av epitelceller, från fästkärmens innehåll av semi-engorged R. microplus. Detta protokoll utnyttjar TCEP och EDTA för att frigöra epitelcellerna från subepiteliala stödvävnaderna och en diskontinuerlig densitetscentrifugeringsgradieNt för att separera epithelceller från andra celltyper. Cellytaproteiner biotinylerades och isolerades från fästkärlepitelcellerna med användning av streptavidinbundna magnetiska pärlor som möjliggjorde nedströmsapplikationer i FACS eller LC-MS / MS-analys.
Introduction
Rhipicephalus microplus , nötkreatursmarken, är den mest betydande ektoparasiten när det gäller ekonomisk påverkan på boskapsindustrin i tropiska och subtropiska regioner, eftersom det vektorerar nötkreaturfekta (babesiosis), anaplasmos och equine piroplasmosis 1 , 2 , 3 , 4 . Ansträngningar har ägnats åt boskapskontroll för att minska skadlig effekt, men konventionella metoder såsom användningen av kemiska akaricider har implicita nackdelar, såsom förekomsten av kemiska rester i mjölk och kött, och ökningen i förekomsten av kemiskt resistenta fästingar 5 , 6 , 7 . Följaktligen har utvecklingen av alternativa metoder för tickkontroll studerats, såsom användning av naturligt resistent boskap, biologisk kontroll (biopesticider) och vaccinInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
I strävan efter proteiner som kan användas som vaccinkandidater är den aktuella forskningen inriktad på tarmkanalen. Midgutväggen är uppbyggd av ett enda lager av epitelceller som ligger på en tunn basal lamina, med utsidan av den basala lamina som bildar ett nätverk av muskler. Ljus- och elektronmikroskopobservationer indikerar att midgutet består av tre typer av celler: reservera (odifferentierade), sekretoriska och matsmältningsämnen. Antalet celltyper varierar avsevärt beroende på den fysiologiska fasen. Sekretoriska och matsmältningsceller härrör från både reservceller 18 , 19 , 20 .
Konstruktionen av cDNA-bibliotekAtt undersöka sammansättningen av tarmkanalen har lett till identifieringen av antigena proteiner, såsom Bm86, som potentiella vaccinkandidater 2 , 3 , 4 . Glykoproteinet Bm86 lokaliseras vid ytan av fästkärlceller och inducerar ett skyddande immunsvar mot nötkreatursmarken ( R. microplus ) hos vaccinerade nötkreatur. Anti-Bm86 IgG-preparat som produceras av den immuniserade värden intas av fästet, känner igen detta antigen på ytan av fästkärlceller, och stör sedan störningar i fästkärlets vävnadsfunktion och integritet. Vacciner baserade på Bm86 antigener har visat effektiv kontroll av R. microplus och Rhipicephalus annulatus, genom att minska antal, vikt och reproduktionskapacitet hos englande kvinnor, vilket resulterar i minskad larvalinfestation i efterföljande fästgenerationer 4 . Bm86-baserade vacciner är emellertid inte effektiva mot alla fäststeg och harVisat sig otillfredsställande effekt mot vissa geografiska stammar av R. microplus , följaktligen har nötkötts- och mejeriindustrin dåligt antagit dessa vacciner 2 , 4 .
Möjligheten att isolera epitelceller från tarmkanalen är en signifikant innovation som skulle möjliggöra framsteg av forskning för att bestämma proteinmembrankompositionen inklusive morfologi och fysiologi under olika miljöförhållanden. Metoden som beskrivs här använder chelateringsmedlet etylendiamintetraättiksyra (EDTA) och reduktionsmedlet tris (2-karboxietyl) fosfin (TCEP) för att frigöra epitelet från dess subepiteliala stödvävnader 10 . Epitelet utvinns efter mekanisk störning av vävnaderna genom skakning följt av diskontinuerlig gradientcentrifugering i Percoll. I det här dokumentet beskrivs en genomförbar och ny teknik för isolering av tarmgropspiThelialceller. Biotinylerade cellytproteiner, isolerade från ytan av dessa epitelceller kan därefter analyseras i nedströmsapplikationer såsom FACS och / eller LC-MS / MS-analys.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nötkreatursinfektioner utgör ett stort problem för boskapsindustrin i tropiska och subtropiska regioner i världen, med den vanligaste kontrollmetoden som är beroende av användningen av akaricider 1 , 4 . Bm86 identifierades tidigare inom epitelytan av tarmgöt som skyddande antigen mot R. microplus infestation 10 , med begränsad framgång som en vaccinstrategi på grund av variationen Bm86 geografisk sekvens och kravet på…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australien) för tillhandahållande av Rhipicephalus microplus- ticks som används för denna studie, och Lucas Karbanowicz för hjälp med videoinspelning.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
- Rodriguez-Valle, M., et al. Efficacy of Rhipicephalus (Boophilus) microplus Bm86 against Hyalomma dromedarii and Amblyomma cajennense tick infestations in camels and cattle. Vaccine. 30, 3453-3458 (2012).
- De Rose, R., et al. Bm86 antigen induces a protective immune-response against Boophilus microplus following DNA and protein vaccination in sheep. Vet. Immunol. Immunopathol. 71, 151-160 (1999).
- García-García, J. C., et al. Sequence variations in the Boophilus microplus Bm86 locus and implications for immunoprotection in cattle vaccinated with this antigen. Exp. Appl. Acarol. 23, 883-895 (1999).
- Abbas, R. Z., Zaman, M. A., Colwell, D. D., Gilleard, J., Iqbal, Z. Acaricide resistance in cattle ticks and approaches to its management: The state of play. Vet. Parasitol. 203, 6-20 (2014).
- Kearney, S. . Acaricide (chemical) resistance in cattle ticks. , (2013).
- Foil, L. D., et al. Factors that influence the prevalence of acaricide resistance and tick-borne diseases. Vet. Parasitol. 125, 163-181 (2004).
- Rodriguez, M., et al. High level expression of the B. microplus Bm86 antigen in the yeast Pichia pastoris forming highly immunogenic particles for cattle. J Biotechnol. 33, 135-146 (1994).
- Rodriguez, M., et al. Effect of vaccination with a recombinant Bm86 antigen preparation on natural infestations of Boophilus microplus in grazing dairy and beef pure and cross-bred cattle in Brazil. Vaccine. 13 (18), 1804-1808 (1995).
- Lew-Tabor, A. E., Rodriguez Valle, M. A review of reverse vaccinology approaches for the development of vaccines against ticks and tick borne diseases. Ticks Tick Borne Dis. 7, 573-585 (2016).
- Capella, A. N., Terra, W. R., Ribeiro, A. F., Ferreira, C. Cytoskeleton removal and characterization of the microvillar membranes isolated from two midgut regions of Spodoptera frugiperda (Lepidoptera). Insect Biochem. Mol. Biol. 27, 793-801 (1997).
- Cioffi, M., Wolfersberger, M. G. Isolation of separate apical, lateral and basal plasma membrane from cells of an insect epithelium. A procedure based on tissue organization and ultrastructure. Tissue Cell. 15, 781-803 (1983).
- Koefoed, B. M. A simple mechanical method to isolate the basal lamina of insect midgut epithelial cells. Tissue Cell. 17, 763-768 (1985).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol. Med. 50, 15-20 (2001).
- Terra, W. R., Costa, R. H., Ferreira, C. Plasma membranes from insect midgut cells. An. Acad. Bras. Ciênc. 78, 255-269 (2006).
- Vargas, A. E., Markoski, M. M., Cañedo, A. D., Helena, F., Nardi, N. B. Identification, isolation and culture of intestinal epithelial stem cells from murine intestine. Stem Cells. 879, 479-490 (2012).
- Autengruber, A., Gereke, M., Hansen, G., Hennig, C., Bruder, D. Impact of enzymatic tissue disintegration on the level of surface molecule expression and immune cell function. Eur. J. Microbiol. Immunol. 2, 112-120 (2012).
- Karhemo, P. R., et al. An optimized isolation of biotinylated cell surface proteins reveals novel players in cancer metastasis. J. Proteomics. 77, 87-100 (2012).
- Obenchain, F. R., Galun, R. Physiology of Ticks. Current Themes in Tropical Science Volume 1. , 201-205 (1982).
- Sonenshine, D., Roe, R. Chapter 3.1. "Biology of Ticks". 1, (2014).
- Raikhel, A. S., Balashov, Y. S. . "An Atlas of Ixodid Tick Ultrastructure" (English Translation). , (1983).
