Purificazione delle proteine superficiali delle cellule biotinilate da<em> Rhipicephalus microplus</em> Cellule epiteliali delle ghiandole
Summary
Una metodologia basata sulla gradiente di centrifugazione a densità modificata è stata utilizzata per isolare le cellule epiteliali del tessuto intestinale di Rhipicephalus microplus . Le proteine legate alle superfici sono state biotinilate e purificate mediante perline magnetiche di streptavidina per l'utilizzo nelle applicazioni a valle.
Abstract
Rhipicephalus microplus – il bestiame bestiame – è l'ectoparasite più significativo in termini di impatto economico sul bestiame come vettore di diversi agenti patogeni. Gli sforzi sono stati dedicati al controllo del bestiame da bere per diminuire i suoi effetti deleteri, con particolare attenzione alla scoperta di candidati vaccinali, come BM86, localizzati sulla superficie delle cellule epiteliali delle ghiandole. La ricerca attuale si concentra sull'utilizzo di cDNA e librerie genomiche, per la ricerca di altri candidati vaccinali. L'isolamento delle cellule gutricole costituisce un importante vantaggio nell'individuare la composizione delle proteine superficiali sulla membrana delle cellule gutiche. Questa carta costituisce un metodo nuovo e fattibile per l'isolamento delle cellule epiteliali, dal contenuto di gocce del polmone R. microplus semiaffuso. Questo protocollo utilizza TCEP e EDTA per rilasciare le cellule epiteliali dai tessuti di supporto subepitheliali e una gradi di centrifugazione a densità discontinuaNt per separare le cellule epiteliali da altri tipi di cellule. Le proteine superficiali delle cellule sono state biotinilate e isolate dalle cellule epiteliali delle ghiandole, usando branelli magnetici legati alla streptavidina, che consentono applicazioni a valle in analisi FACS o LC-MS / MS.
Introduction
Rhipicephalus microplus , il segno del bestiame, è l'ectoparasite più significativo in termini di impatto economico sull'industria del bestiame delle regioni tropicali e subtropicali in quanto vectors bovine tick-tick (babesiosis), anaplasmosis e piroplasmosis equestre 1 , 2 , 3 , 4 . Gli sforzi sono stati dedicati al controllo dei bovini da bestiame, per diminuire l'effetto deleterio, tuttavia i metodi convenzionali come l'uso di acaricidi chimici hanno inconvenienti impliciti, come la presenza di residui chimici nel latte e la carne e l'aumento della prevalenza di zecche chimicamente resistenti 5 , 6 , 7 . Di conseguenza, è stato studiato lo sviluppo di metodi alternativi di controllo del bersaglio, come l'uso di bovini di resistenza naturale, il controllo biologico (biopesticidi) e il vaccinoInes 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 .
Nel perseguimento di proteine in grado di essere utilizzate come candidati per il vaccino, la ricerca attuale è incentrata sul guscio del timo. La parete midgut è costruita da un unico strato di cellule epiteliali che poggiano su una sottile lamina basale, con l'esterno della lamina basale che forma una rete muscolare. Le osservazioni del microscopio della luce e dell'elettronica indicano che il midgut è costituito da tre tipi di cellule: riserva (indifferenziata), secrezione e digestione. Il numero di tipi di cellule varia notevolmente a seconda della fase fisiologica. Le cellule di secretory e digestive sono entrambe originate dalle cellule di riserva 18 , 19 , 20 .
La costruzione di librerie cDNAPer esaminare la composizione dell'intestino del guscio ha portato all'identificazione di proteine antigeniche, come Bm86, come candidati potenziali per la vaccinazione 2 , 3 , 4 . La glicoproteina Bm86 è localizzata sulla superficie delle cellule gutiche del tick e induce una risposta immunitaria protettiva contro il bestiame bovino ( R. microplus ) nei bovini vaccinati. Le IgG anti-Bm86 prodotte dall'host immunizzato vengono ingerite dal ticchettio, riconoscono questo antigene sulla superficie delle cellule intestinali, e quindi disturbano la funzionalità e l'integrità del tessuto intestinale. I vaccini basati sugli antigeni Bm86 hanno mostrato un controllo efficace di R. microplus e Rhipicephalus annulatus, riducendo il numero, il peso e la capacità riproduttiva delle femmine incurvando, con conseguente riduzione delle infestazioni di larvali nelle successive generazioni di ticchetti 4 . Tuttavia, i vaccini basati su Bm86 non sono efficaci contro tutte le fasi del tick e hannoHa dimostrato un'efficacia insoddisfacente nei confronti di alcuni ceppi geografici di R. microplus , di conseguenza le industrie bovine e lattiero-caseari hanno adottato male questi vaccini 2 , 4 .
La capacità di isolare le cellule epiteliali dall'intestino è una innovazione significativa che consentirebbe la progressione della ricerca a determinare la composizione della membrana proteica, compresa la morfologia e la fisiologia in condizioni ambientali differenti. Il metodo qui descritto utilizza l'agente chelante acido etilendiamintetraoacetico (EDTA) e l'agente riducente tris (2-carbossiletil) fosfina (TCEP) per rilasciare l'epitelio dai suoi tessuti di supporto sub-epiteliali 10 . L'epitelio viene recuperato a seguito di scosse meccaniche dei tessuti agitando, seguita da centrifugazione a gradiente discontinua in Percoll. Questo articolo descrive una tecnica fattibile e novella per l'isolamento di epi di zuccheroCellule teliali. Le proteine superficiali delle cellule biotinilate, isolate dalla superficie di queste cellule epiteliali, possono successivamente essere analizzate in applicazioni a valle come FACS e / o analisi LC-MS / MS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le infestazioni di zootecnia costituiscono un grave problema per l'industria del bestiame nelle regioni tropicali e subtropicali del mondo, con il metodo più comune di controllo dipendente dall'uso degli acaricidi 1 , 4 . Bm86 è stato precedentemente individuato all'interno della superficie epiteliale della ghiera di zecca come antigene protettivo contro l'infestazione di R. microplus 10 , con un successo limita…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vogliono ringraziare la Biosecurity Tick Colony (Queensland Department of Agriculture & Fisheries, Australia) per la fornitura di Rhipicephalus microplus ticks utilizzati per questo studio e Lucas Karbanowicz per l'assistenza con la ripresa video.
Materials
| 0.4% Trypan Blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 3322 | |
| 100mM Carbonate Buffer | 3.03 g Na2CO3, 6.0 g NaHCO3 1000 ml distilled water pH 9.6 | ||
| 16 mL centrifuge tubes with sealing cap | Thermo Scientific | 3138-0016 | Cool in ice prior to gradient |
| 250 µM cell strainer | Thermo Fisher | 87791 | |
| 3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine (TMB) Liquid Substrate System for ELISA | Sigma | T0440 | Stored at 4C |
| 30% Hydrogen Peroxide | Labscene | BSPA5.500 | |
| 4-20% Tris-MOPS Gel | Gen Script | M42015 | |
| 4-Chloro-1-naphthol tablet | Sigma-Aldrich | C6788 | |
| 50 mL Falcon Tube | Corning Blue | 30 x 115mm style. Polyproplyene conical tube. | |
| 70 µM cell strainer | BD Falcon | 352350 | |
| AP15 filter paper | Millipore | AO1504200 | |
| Biotin (Type A) Conjugation Kit | Abcam | Ab102865 | |
| Dissection microscope | Olympus | SZX7 | |
| DP Manager | Olympus | 2.2.1.195 | Cell imagery software |
| Duct Tape | Home Handyman | 48mm x 25mm Duct Tape | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | DMEM – ice cold for protocol |
| EDTA | Amresco | 0105-500G | |
| F96 Maxisorp Immuno Plate | Nunc | 439454 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | 12003C | FCS |
| Fluorescence microscope | Olympus | BX51 | |
| Fluoroshield with DAPI | Sigma-Aldrich | F6057-20ML | DAPI |
| Forceps | Dumont | #9 Dumont – Switerzland | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | Glycerol for molecular biology >99% |
| Glycine | Sigma-Aldrich | 410225 | |
| Hand-Held Counter | Officeworks | JA0376230 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Sigma Life Sciences | H9394 | HBSS – ice cold for protocol |
| Hemacytometer | Optik Lakor | – | – |
| L-Glutathione oxidized | Sigma-Aldrich | G4376 | |
| Magnetic Separation Stand | Novagen | – | 4-Tube Magnetic Separation Rack |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 179337 | |
| Milli-Q Water | Millipore | ZRXQ003WW | Integral Water Purification System for Ultrapure Water |
| Nitrocellulose Membrane | Life Sciences | 66485 | 30cm x 3M pure nitrocellulose membrane |
| PageRuler Prestained protein Ladder | Thermo-Fisher | SM0671 | |
| PBS | 1.16 g Na2HPO4, 0.1 g KCl, 0.1 g K3PO4, 4.0 g NaCl (500 ml distilled water) pH 7.4 | ||
| Percoll | Sigma-Aldrich | P1644-500ML | |
| Peristaltic Pump | Masterflex | 7518-10 | |
| Phosphoric Acid | Sigma-Aldrich | P6560 | |
| Pierce Protein-Free T20 PBS Blocking Buffer | Thermo-Scientific | 37573 | Stored at 4C. Blocking Buffer |
| Protease Inhibitor Cocktail | Sigma-Aldrich | P8215-5ML | PIC – stored at -20 °C |
| Quick Start Bradford Dye Reagent 1x | Biorad | 500-0205 | For Bradford Assay |
| Quick Start BSA Standards | Biorad | 500-0207 | BSA standards for Bradford Assay |
| Scalpel | Lab. Co | Size 11 Scalpel | |
| SilverQuest TM Staining Kit | Invitrogen | LC6070 | |
| Simply Blue TM Safe Stain | Invitrogen | LC6060 | |
| Sorvall C6+ Ultracentrifuge | Thermo Scientific | 46910 | |
| Streptavidin (HRP) | Abcam | AB7403 | |
| Streptavidin Magnetic Beads | New England Biolabs | S1420S | |
| Super Glue – Ultra Fast Mini | UHU | UHU Super Glue 1mg. Ultra Fast mini | |
| Table-top Centrifuge | Eppendorf | 22331 | |
| TCEP | Thermo Fisher | 20490 | |
| Triton X-100 | Biorad | 161-0407 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287-500ML | |
| Vortex Mixer | Ratek | VM1 | |
| Water Bath | Grant | GD100 |
References
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