Whitefly에서 Endosymbionts의 추출을위한 방법<em> 베미 시아 타바시</em
Summary
여기, 우리는 해부 및 여과를 통해 흰 반점 Bemisia tabaci 에서 endosymbionts를 분리하는 프로토콜을 제시한다. 증폭 후, DNA 샘플은 endosymbionts와 whitefly 사이의 mutualism의 후속 시퀀싱 및 연구에 적합합니다.
Abstract
박테리아 공동체는 그들의 숙주와 친밀한 관계를 형성하고 대부분의 경우 숙주에게 이점을줍니다. 유전체 정보는 숙주에서 세균 공생체의 기능과 진화를 연구하는 데 중요합니다. 대부분의 공생 균 은 시험 관내 에서 배양 될 수 없으므로, 게놈 시퀀싱을위한 박테리아의 적절한 양을 분리하는 방법은 매우 중요합니다. 흰 반점 Bemisia tabaci 에서 여러 가지 내인성이 확인되었고 여러 가지 접근법을 통해 해충의 발생과 번식에 중요 할 것으로 예측됩니다. 그러나 협회를 뒷받침하는 메커니즘은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 장애물은 부분적으로 세균 증식 억제 물질 인 흰가루병에있는 내막 곰팡이가 숙주 세포에서 분리되기 어렵다는 사실에서 기인합니다. 여기에서 우리는 주로 해면체 B. tabaci 에서 endosymbionts의 동정, 추출 및 정제를위한 단계별 프로토콜을보고한다 .켜고 여과하십시오. 다른 endosymbiont 종의 혼합물이긴하지만,이 방법에 의해 준비된 endosymbiont 샘플은 B. tabaci 에서 endosymbionts의 가능한 역할의 후속 게놈 시퀀싱 및 분석에 적합합니다. 이 방법은 다른 곤충에서 내재물을 분리하는 데 사용될 수도 있습니다.
Introduction
상대적 숙주와 친밀한 공생 관계를 형성하는 박테리아는 절지 동물에서 널리 퍼져있다 1 . endosymbionts는 거의 모든 발달 단계 5 에서 영양 대사, 번식, 환경 스트레스에 대한 반응 2 , 3 , 4 등과 같은 숙주의 양상에 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다. 그러나 협회를 뒷받침하는 메커니즘은 아직 많이 알려져 있지 않습니다. 유전체학은 박테리아의 잠재적 인 기능과 역할을 연구 할 때 우선 순위이며 중요합니다. 분류 학적 상태, 기능 유전자, 대사 경로, 분비 시스템과 같은 몇 가지 기본 정보는 공생에서 공생 공생체의 잠재적 역할에 대한 조명을 밝히는 게놈 서열로부터 추론 할 수 있습니다. 높은 처리량 시퀀싱의 개발로 방대한 세균 게놈이 시퀀싱되었습니다여러 가지 기능이 밝혀졌다.
내배체는 진딧물 7 , 벌레 8 , 유문 9 , 갈색 planthoppers 10 및 매미 11 과 같은 반월에서 매우 중요합니다. 예를 들어, 진딧물의 Buchnera 는 필수적인 공생체 로서 진딧물 유전체 12 의 유전자와 함께 필수 아미노산 생합성에 관여하는 것으로 입증되었습니다. 또한 Buchnera의 전사 조절 또한 밝혀졌다. psyllids에서는 Carsonella 가 서열화되어 가장 작은 박테리아 게놈을 14 번 발견했습니다. endosymbionts의 이러한 모든 특징은 게놈 서열을 기반으로하고 유추됩니다. 이러한 endosymbionts가 시험 관내 에서 배양 될 수 없기 때문에, seq에 적합한 박테리아를 분리하기 위해 여러 가지 접근법이 적용되었습니다어젠 싱. 진딧물에서, endosymbionts는 원심 분리 및 여과를 통해 추출하고 추가 게놈 및 transcriptomic 분석 5에 적용 됩니다. 갈색 딱정벌레에서는 곤충 게놈 전체와 함께 내분비물이 서열화됩니다 10 .
Whitefly B. tabaci 는 35 종 이상의 형태 학적으로 구분할 수없는 종 (비밀 종)을 포함하고있는 종 복합체이며, 그 중 2 종의 침입 종이 전 세계에 침입하여 농산물에 막대한 피해를 입혔습니다 15 . 주목할 점은 B. tabaci 종의 내분비는 해충의 발생에 중요성을 보여 주었다. 현재까지, 8 종의 endosymbiont가 흰 반딧불에서 확인되었다. 그 중 하나는 obligent symbiont, Candidatus Portiera aleyrodidarum, 7 명의 보조 공생 자인 Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,em> Wolbachia, Fritschea 및 Hemipteriphilus 는 17 , 18을 정의했다.
이전에 기술 된 반 형제와 달리 흰 반점 B. tabaci 는 길이가 1mm에 불과한 매우 작은 벌레입니다. 대부분의 endosymbionts는 bacteriocytes 19 ( B. tabaci 에서 세균을 더 형성하는 symbionts를 포함하는 특수 세포)에 국한되어 있습니다. 또한, 이러한 내재화는 시험 관내에서 배양 할 수 없다. B. tabaci 에서 endosymbionts를 얻는 유일한 방법은 박테리아를 해부하는 것입니다. 그러나 해부학에 어려움이 있습니다. 첫째, 깨지기 쉬운 세균은 흰 반점의 다른 조직과 항상 연결되어 분리되기 어렵습니다. 두 번째로, 흰 반점의 작은 크기는 충분한 박테리아의 고립을 제한합니다. 세 번째로, 세균 내에서 내재물 (endosymbion)이 번식하여 한 종의 세균을 얻기가 매우 복잡합니다.
<p cl여기에서 우리는 후속 metagenome sequencing을 위해 흰자위 내막을 분리하는 간단하고 저렴한 프로토콜을보고한다. 해부, 정화 및 증폭을 통해 적절한 endosymbiont DNA를 얻을 수 있었고 박테리아의 종을 확인할 수있었습니다. 기술 된 프로토콜은 다른 절지 동물에서 유사하게 사용될 수있다.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구에 대한 재정 지원은 국가 핵심 연구 및 개발 프로그램 (2016YFC1200601)과 중국 국립 자연 과학 재단 (31390421)에 의해 제공되었습니다.
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
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