Beyaz sinekten Endosimbonların Çıkarılması İçin Yöntemler<em> Bemisia tabaci</em
Summary
Burada, beyaz sinek Bemisia tabaci'den endosimiviyonları diseksiyon ve filtrasyon yoluyla izole etmek için bir protokol sunuyoruz. Büyütmeden sonra DNA örnekleri, endosimbiyonlar ile beyaz sinek arasındaki karşılıklı etkileşimin izlenmesi ve izlenmesi için uygundur.
Abstract
Bakteriyel sembiyonlar ev sahipleri ile samimi bir ilişki kurarlar ve çoğu durumda ev sahiplerine avantaj sağlarlar. Genomik bilgi, konukçularındaki bakteri sembiyonlarının işlevlerini ve evrimini incelemek için kritik önem taşır. Çoğu simbiyon, in vitro ortamda kültürlenemediğinden, genom dizilimi için yeterli sayıda bakteri izole etme yöntemleri çok önemlidir. Beyaz sinek Bemisia tabaci'de, çeşitli endozimbiyonlar tespit edilmiş ve zararlıların gelişimi ve çoğaltılmasında çoklu yaklaşımlarla önemi olması öngörülmüştür. Bununla birlikte, derneklerin altında yatan mekanizma halen bilinmiyor. Engel, kısmen bakteriositlerle sınırlandırılmış beyaz sinir hücrelerindeki endozimbiyonların konukçu hücrelerden ayrılması zor olmasından kaynaklanmaktadır. Burada beyaz sinek B. tabaci'den başta dissekte olmak üzere endozimbiyonların tanımlanması, ekstraksiyonu ve saflaştırılması için bir adım adım protokol bildirilmektedirVe filtrasyon. Bu yöntemle hazırlanan endosymbiont örnekleri, yine de farklı endosimbit türünün bir karışımı olmasına rağmen, B. tabaci'de endozimbiyonların olası rollerinin analizi ve izlenmesi için uygundur. Bu yöntem aynı zamanda endozimiviyonları diğer böceklerden ayırmak için de kullanılabilir.
Introduction
Nispeten konaklarla yakın bir simbiyotik ilişki oluşturan bakteriler eklembacaklılarda yaygın 1 . Beslenme metabolizması, reprodüksiyon, çevresel streslere verilen cevaplar 2 , 3 , 4 vb. Gibi neredeyse her gelişme evresindeki endosymbionların konukçuların özelliklerini etkilediği gösterilmiştir 5 . Bununla birlikte, derneklerin altında yatan mekanizma halen bilinmiyor. Bakterilerin potansiyel işlevleri ve rolleri incelendiğinde genomik öncelik ve önem taşır. Bazı temel bilgiler, yani taksonomik durum, fonksiyonel genler, metabolizma yolları, salgı sistemleri, simbiyozlarda sembiyonların potansiyel rollerini aydınlatan genom dizilerinden çıkarılabilir. Yüksek verimli sekanslama geliştirildiğinde, çok sayıda bakteri genomu dizilenmiştir.Çeşitli işlevler gösterdi 6 .
Endosymbionts, hemipteranlarda yaprak bitleri 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , kahverengi planthoppers 10 ve cicadas 11 gibi hayati öneme sahiptir. Örneğin, zorunlu sembiyot olan yaprak bitleri içindeki Buchnera'nın , yaprak biti genomundan genler ile birlikte gerekli amino asitler biyosentezine karıştığı gösterilmiştir. Dahası, 13 Buchnera'nın transkripsiyonel düzenlenmesi de ortaya çıkarılmıştır 13 . Psyllids'de, Carsonella sıralanır ve şimdiye kadar bulunan en küçük bakteri genomasına 14 puan yerleşmiştir. Endozimbiyonların tüm bu belirteçleri genom dizilerinden kaynaklanır ve çıkarılır. Bu endozimbiyonlar in vitro ortamda kültürlenemediğinden, sıra için yeterli bakteri izole etmek için çeşitli yaklaşımlar uygulanmıştıruencing. Yaprak bitlerinde, endozimbiyonlar santrifüjleme ve filtrasyon yoluyla ekstrakte edilir ve daha ileri genomik ve transkriptomik analizlere tabi tutulur 5 . Kahverengi plantopperlerde endozimbiyonlar bütün böcek genomu 10 ile birlikte dizilir.
Whitefly B. tabaci , 35'den fazla morfolojik olarak ayırt edilemez türü (kriptik türler) içeren bir tür kompleksidir ve bunların arasında iki istilacı tür tüm dünyayı işgal etti ve tarımsal üretime büyük zarar verdi 15 . Dikkat edin, B. tabaci türleri içerisindeki endosimiviyonlar zararlıların gelişiminde önem taşırlar 16 . Bugüne kadar, zorunlu sembiyot , Candidatus Portiera aleyrodidarum ve yedi sekonder sembiyot dahil olmak üzere , beyaz sinekte sekiz endonimviyon belirlendi Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium ,Em> Wolbachia, Fritschea ve Hemipteriphilus 17 , 18'i tanımladı .
Daha önce tarif edilen hemipteranlardan farklı olarak, beyaz sinek B. tabaci sadece 1 mm uzunluğunda çok küçük bir böcektir. Çoğu endozimbiyon, bakteriositler 19 (B. tabaci'de bakteri oluşturan simbiyon içeren özel hücreler) ile sınırlandırılmıştır. Buna ek olarak, bu endozimbiyonlar in vitro kültürlenemezler. B. tabaci'den endozimbiyon elde etmenin tek yolu bakteriyi ayırmaktır. Bununla birlikte, diseksiyonda zorluk vardır. Öncelikle, kırılgan bakteriom her zaman whitefly'un diğer dokuları ile birbirine bağlanır ve bu da ayrılması zor olur. İkincisi, beyaz sinekin küçük boyutu, yeterli bakteri oluşumunu sınırlar. Üçüncü olarak, endozimbiyonlar bakteride birleşir, tek bir bakteri türü edinmek son derece karmaşık hale gelir.
<p clAss = "jove_content"> Burada, whitefly endosimbiyonlarını izleyen metagenome dizilimi için basit ve ucuz bir protokol bildirdik. Diseksiyon, arıtma ve amplifikasyon yoluyla yeterli endozimivyon DNA elde edilebilir ve bakteri türleri teyit edilebilir. Tarif edilen protokol, diğer eklembacaklılarda benzer şekilde kullanılabilir.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma için maddi destek Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (2016YFC1200601) ve Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (31390421) tarafından sağlanmıştır.
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O’Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci’ strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
