Metoder för extraktion av endosymbioner från vitflyget<em> Bemisia tabaci</em
Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera endosymbioner från whitefly Bemisia tabaci genom dissektion och filtrering. Efter amplifiering är DNA-proverna lämpliga för efterföljande sekvensering och undersökning av ömsesidigheten mellan endosymbioner och whitefly.
Abstract
Bakterie symbionter bildar ett intimt förhållande med sina värdar och ger i högsta grad fördelar till värdarna. Genomisk information är kritisk för att studera funktioner och utveckling av bakteriella symbioner i deras värd. Eftersom de flesta symbionter inte kan odlas in vitro är metoder för att isolera en adekvat mängd bakterier för genom-sekvensering väldigt viktiga. I Whitefly Bemisia tabaci har ett antal endosymbioner identifierats och förutspås vara av betydelse vid utveckling och reproduktion av skadedjur genom flera tillvägagångssätt. Mekanismen som ligger bakom föreningarna förblir dock i stort sett okänd. Hindern beror delvis på det faktum att endosymbionterna i whitefly, mestadels begränsad i bakteriocyter, är svåra att separera från värdcellerna. Här rapporterar vi ett steg för steg protokoll för identifiering, extraktion och rening av endosymbioner från whitefly B. tabaci huvudsakligen genom dissektiPå och filtrering. Endosymbiont-prov framställda med denna metod, även om det fortfarande är en blandning av olika endosymbiont-arter, är lämpliga för efterföljande genom-sekvensering och analys av de möjliga rollerna hos endosymbioner i B. tabaci . Denna metod kan också användas för att isolera endosymbioner från andra insekter.
Introduction
Bakterier som bildar ett intimt symbiotiskt förhållande med relativa värdar är utbredd i arthropods 1 . Endosymbionterna har visat sig påverka värden hos värdar, såsom näringsmetabolism, reproduktion, respons på miljöbelastningar 2 , 3 , 4 etc. , i nästan alla utvecklingsstadier 5 . Mekanismen som ligger bakom föreningarna är dock fortfarande i stort sett okänd. Genomik har prioritet och betydelse när man studerar potentiella funktioner och roller hos bakterier. Vissa grundläggande uppgifter, det vill säga den taxonomiska statusen, funktionella gener, metabolismvägarna, sekretionssystemen, kan härledas från genom-sekvenser, vilket lyser på symbionternas möjliga roller i symbios. Med utvecklingen av hög genomströmningssekvensering har ett stort antal bakteriegener sekvenserats wMed olika funktioner avslöjade 6 .
Endosymbionter är av vital betydelse för hemipteraner, såsom bladlöss 7 , bedbugs 8 , psyllids 9 , bruna planthoppers 10 och cicadas 11 . Till exempel har Buchnera i bladlus , som obligatorisk symbiont, visat sig vara involverad i essentiell aminosyrorbiosyntes, tillsammans med generna från bladlusgenomet 12 . Vidare avslöjas transkriptionsreglering av Buchnera 13 . I psyllider sekvenseras Carsonella och rankas det minsta bakteriegenomet som någonsin hittats 14 . Alla dessa kännetecken för endosymbioner är baserade och härledda från genometsekvenserna. Eftersom dessa endosymbioner inte kan odlas in vitro har flera sätt applicerats för att isolera adekvata bakterier för sequencing. I bladlus extraheras endosymbioner genom centrifugering och filtrering och utsätts för ytterligare genomisk och transkriptomisk analys 5 . I bruna planthoppare sekvenseras endosymbioner tillsammans med hela insektsgenomet 10 .
Whitefly B. tabaci är ett artskomplex som innehåller mer än 35 morfologiskt oskiljbara arter (kryptiska arter), bland vilka två invasiva arter har invaderat över hela världen och orsakat enorma skador på jordbruksproduktionen 15 . Av anmärkning har endosymbioner inom B. tabaci- arter visat betydelse vid utvecklingen av skadegörarna 16 . Hittills har åtta endosymbioner identifierats i whiteflyen, inklusive den obligatoriska symbionten, Candidatus Portiera aleyrodidarum och sju sekundära symbionter Hamiltonella , Rickettsia , Arsenophonus , Cardinium , <Em> Wolbachia, Fritschea och Hemipteriphilus definierade 17 , 18 .
Till skillnad från de tidigare beskrivna hemiptererna är vitflödet B. tabaci en extremt liten insekt med en längd på endast 1 mm. De flesta endosymbioner är begränsade till bakteriocyter 19 (specialiserade celler innehållande symbionter, vilka vidare bildar bakteriom i B. tabaci ). Dessutom kan dessa endosymbioner inte odlas in vitro . Det enda sättet att erhålla endosymbionter från B. tabaci är att dissekera bakterien ut. Det finns dock svårigheter i dissektionen. För det första kopplar den bräckliga bakterien alltid med andra vävnader av vitflugan, som är svår att separera. För det andra begränsar den lilla storleken av whitefly isoleringen av tillräckligt med bakterier. För det tredje klarar endosymbionter i bakterien, vilket gör det ytterst komplicerat att förvärva en enda bakterieart.
<p clAss = "jove_content"> Här rapporterar vi ett enkelt och billigt protokoll för att isolera whitefly endosymbionter för efterföljande metagenom-sekvensering. Genom dissektion, rening och amplifiering kunde adekvat endosymbiont-DNA erhållas och bakterierna kunde bekräftas. Det beskrivna protokollet kan användas på liknande sätt i andra arthropoder.Protocol
Representative Results
Discussion
Since the endosymbionts within whiteflies cannot be cultured in vitro, dissection and assembling bacteriocytes is an effective way to obtain enough genetic material of endosymbionts. Before dissection, the species of whitefly and endosymbionts involved should be explicitly confirmed. The whitefly B. tabaci is a species complex with more than 35 morphologically indistinguishable species and different cryptic species may contain different endosymbionts. Portiera is uniformly harbored as an obliga…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ekonomiskt stöd till denna studie tillhandahölls av National Key Research and Development Program (2016YFC1200601) och National Natural Science Foundation of China (31390421).
Materials
| Taq DNA polymerase | Takara | R001A | including rTaq, 10×Buffer and dNTP |
| Gel DNA extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| DNA sample sequencing system | ABI | ABI-3730XL | |
| Microtome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscopy | Hitachi | H-7650 TEM | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 20 μL microloader | Eppendorf | F2771951 | |
| Filter holder | Millipore | SX0001300 | |
| Filter membrane filter | Millipore | SMWP001300 | 5.0 μm SMWP |
| REPLI-g UltraFast Mini Kit | Qiagen | 150033 | DNA amlification kit |
| NanoDrop | Thermo Scientific | NanoDrop 2000 | |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q33216 | |
| Genome Sequencer | Illumina | Hiseq 2000 |
References
- Buchner, P. Endosymbiosis of animals with plant microorganisms. J. Basic Microbiol. 7 (2), (1967).
- Sloan, D. B., Moran, N. A. Endosymbiotic bacteria as a source of carotenoids in whiteflies. Biol. Letters. 8 (6), 986-989 (2012).
- Stouthamer, R., Breeuwer, J. A., Hurst, G. D. Wolbachia pipientis: microbial manipulator of arthropod reproduction. Annu. Rev. Microbiol. 53, 71-102 (1999).
- Brumin, M., Kontsedalov, S., Ghanim, M. Rickettsia influences thermotolerance in the whitefly Bemisia tabaci B biotype. Insect Sci. 18 (1), 57-66 (2011).
- Hansen, A. K., Degnan, P. H. Widespread expression of conserved small RNAs in small symbiont genomes. ISME J. 8, 2490-2502 (2014).
- Moran, N. A., McCutcheon, J. P., Nakabachi, A. Genomics and evolution of heritable bacterial symbionts. Annu. Rev. Genet. 42, 165-190 (2008).
- Shigenobu, S., Watanabe, H., Hattori, M., Sakaki, Y., Ishikawa, H. Genome sequence of the endocellular bacterial symbiont of aphids Buchnera sp. APS. Nature. 407, 81-86 (2000).
- Nikoh, N., et al. Evolutionary origin of insect-Wolbachia nutritional mutualism. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111 (28), 10257-10262 (2014).
- Sloan, D. B., et al. Parallel histories of horizontal gene transfer facilitated extreme reduction of endosymbiont genomes in sap-feeding insects. Mol. Biol. Evol. 31 (4), 857-871 (2014).
- Xue, J., et al. Genomes of the rice pest brown planthopper and its endosymbionts reveal complex complementary contributions for host adaptation. Genome Biol. 15 (12), 521 (2014).
- Campbell, M. A., et al. Genome expansion via lineage splitting and genomereduction in the cicada endosymbiont Hodgkinia. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112 (33), 10192-10199 (2015).
- Wilson, A. C., et al. Genomic insight into the amino acid relations of the pea aphid, Acyrthosiphon pisum, with its symbiotic bacterium Buchnera aphidicola. Insect Mol. Biol. 19, 249-258 (2010).
- Degnan, P. H., Ochman, H., Moran, N. A. Sequence conservation and functional constraint on intergenic spacers in reduced genomes of the obligate symbiont Buchnera. PLoS Genet. 7 (9), e1002252 (2011).
- Nakabachi, A., et al. The 160-kilobase genome of the bacterial endosymbiont Carsonella. Science. 314 (5797), 267 (2006).
- De Barro, P. J., Liu, S. S., Boykin, L. M., Dinsdale, A. B. Bemisia tabaci: a statement of species status. Annu. Rev. Entomol. 56, 1-19 (2011).
- Himler, A. G., et al. Rapid spread of a bacterial symbiont in an invasive whitefly is driven by fitness benefits and female bias. Science. 332 (6026), 254-256 (2011).
- Bing, X. L., Ruan, Y. M., Rao, Q., Wang, X. W., Liu, S. S. Diversity of secondary endosymbionts among different putative species of the whitefly Bemisia tabaci. Insect Sci. 20 (2), 194-206 (2013).
- Bing, X. L., Yang, J., Zchori-Fein, E., Wang, X. W., Liu, S. S. Characterization of a newly discovered symbiont of the whitefly Bemisia tabaci (Hemiptera: Aleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 79 (2), 569-575 (2013).
- Kliot, A., et al. Fluorescence in situ hybridizations (FISH) for the localization of viruses and endosymbiotic bacteria in plant and insect tissues. J. Vis. Exp. (84), e51030 (2014).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Rao, Q., et al. Genome reduction and potential metabolic complementation of the dual endosymbionts in the whitefly Bemisia tabaci. BMC Genomics. 16 (1), 226 (2015).
- Thao, L. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zhu, D. T., et al. Sequencing and comparison of the Rickettsia genomes from the whitefly Bemisia tabaci Middle East Asia Minor I. Insect Sci. 23 (4), 531-542 (2016).
- Gottlieb, Y., et al. Identification and localization of a Rickettsia sp. in Bemisia tabaci (HomopteraAleyrodidae). Appl. Environ. Microbiol. 72 (5), 3646-3652 (2006).
- Zhang, C. R., et al. Differential temporal changes of primary and secondary bacterial symbionts and whitefly host fitness following antibiotic treatments. Sci. Rep. 5, 15898 (2015).
- Shan, H. W., et al. Temporal changes of symbiont density and host fitness after rifampicin treatment in a whitefly of the Bemisia tabaci species complex. Insect Sci. 23 (2), 200-214 (2016).
- Zchori-Fein, E., Brown, J. K. Diversity of prokaryotes asscociated with Bemisia tabaci (Gennadius) (Hemiptera: Aleyrodidae). Ann. Entomol. Soc. Am. 95 (6), 711-718 (2002).
- Thao, M. L., Baumann, P. Evolutionary relationships of primary prokaryotic endosymbionts of whiteflies and their hosts. Appl. Environ. Microbiol. 70 (6), 3401-3406 (2004).
- Zchori-Fein, E., Perlman, S. J. Distribution of the bacterial symbiont Cardinium in arthropods. Mol. Ecol. 13 (7), 2009-2016 (2004).
- O’Neill, S. L., Giordano, R., Colbert, A. M., Karr, T. L., Robertson, H. M. 116S rRNA phylogenetic analysis of the bacterial endosymbionts associated with cytoplasmic incompatibility in insects. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89 (7), 2699-2702 (1992).
- Nirgianaki, A. Wolbachia infections of the whitefly Bemisia tabaci. Curr. Microbiol. 47 (2), 93-101 (2003).
- Everett, K. D., Thao, M. L., Horn, M., Dyszynski, G. E., Baumann, P. Novel chlamydiae in whiteflies and scale insects: endosymbionts ‘Candidatus Fritschea bemisiae’ strain Falk and ‘Candidatus Fritschea eriococci’ strain Elm. Int. J. Syst. Evol. Micr. 55, 1581-1587 (2005).
