전환 가능한 음향 및 광학 해상도 Photoacoustic Microscopy for<em> In Vivo</em> 소 동물 혈관 조영술
Summary
여기에는 생체 내 동일한 샘플 에서 심도 깊은 곳에서의 고해상도 이미징과 저해상도 깊은 조직 이미징이 가능한 스위칭 가능한 음향 해상도 (AR) 및 광학 해상도 (OR) 광 음향 현미경 (AR-OR-PAM) 시스템이 시연됩니다.
Abstract
Photoacoustic microscopy (PAM)는 광학 및 초음파를 모두 결합한 빠르게 성장하는 인비 보 이미징 양식으로 고해상도 의 광학 평균 자유 경로 (~ 1 mm 피부)를 넘어서는 침투를 제공합니다. 광학 흡수 콘트라스트와 초음파의 높은 공간 해상도를 단일 양식으로 결합함으로써이 기술은 심부 조직을 투과 할 수 있습니다. 광 음향 현미경 검사 시스템은 음향 해상도가 낮고 탐침 깊이가 크거나 광학 해상도가 높고 탐침을 얕게 가질 수 있습니다. 단일 시스템으로 높은 공간 해상도와 큰 깊이의 침투를 달성하는 것은 어려운 일입니다. 이 작품은 얕은 깊이에서 고해상도 이미징과 생체 내 동일한 샘플의 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 AR-OR-PAM 시스템을 제시합니다. 음향 집속을 사용하여 광학 집속을 사용하는 1.4 mm 이미징 깊이와 7.8 mm 이미징 깊이로 45 μm의 측면 해상도를 사용한 4 μm의 측면 해상도결합 된 시스템을 사용하여 시연되었습니다. 여기서 생체 내 소 동물 혈관 조영술은 생물학적 이미징 능력을 입증하기 위해 수행됩니다.
Introduction
광학 결맞음 단층 촬영, 공 촛점 현미경 검사 및 다 광자 현미경 검사와 같은 고해상도 광학 이미징 양식은 많은 이점을 가지고 있습니다. 그러나 공간 해상도는 이미징 깊이가 증가함에 따라 크게 감소합니다. 이것은 연조직 1 , 2 에서의 빛 전달의 확산 성 때문입니다. 광학 여기와 초음파 검출의 통합은 깊은 조직에서의 고해상도 광학 이미징의 과제를 극복 할 수있는 솔루션을 제공합니다. Photoacoustic microscopy (PAM)는 다른 광학 이미징 양식보다 더 깊은 이미징을 제공 할 수있는 하나의 모달입니다. 그것은 성공적으로 생체 내 구조, 기능, 분자 및 세포 이미징에 적용되었습니다 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 </sup강한 광 흡수 콘트라스트와 초음파의 높은 공간 해상도를 결합하여> 9 , 10 , 11 , 12 , 13 연구를 수행했습니다.
PAM에서 짧은 레이저 펄스가 조직 / 샘플을 조사합니다. 발색단 ( 예 : 멜라닌, 헤모글로빈, 물 등 )에 의한 빛의 흡수는 온도 상승을 일으키며 결과적으로 음향 파 (photoacoustic waves)의 형태로 압력 파를 생성합니다. 생성 된 광 음파는 조직 경계 외부의 광대역 초음파 변환기로 감지 할 수 있습니다. 약한 광학 및 타이트한 음향 집속을 이용하여 음향 해상도 광 음향 현미경 (AR-PAM) 14 , 15 , 16 에서 심 조직 영상을 얻을 수 있습니다. AR에서-PAM, 45 μm의 수평 해상도 및 3 mm까지의 이미징 깊이가 시연되었습니다. 단일 모세관 (~ 5 μm)을 음향 적으로 해결하려면 400 MHz 이상의 중심 주파수에서 작동하는 초음파 변환기가 필요합니다. 이러한 높은 주파수에서, 침투 깊이는 100μm 미만이다. 단단한 음향 집속으로 인한 문제는 엄격한 광학 집속을 사용하여 해결할 수 있습니다. 광학 해상도 광 음향 현미경 (OR-PAM)은 단일 모세관 또는 단일 셀 17 을 분해 할 수 있으며 0.5 μm의 횡 분해능은 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24에 이릅니다 . 광자 나노 젯 (photonic nanojet)을 사용하면 회절 한계 해상도 이상의 해상도를 얻을 수 있습니다.n 25 , 26 . OR-PAM에서, 침투 깊이는 집속 (light focusing)으로 인해 제한되며, 생물학적 조직 ( 23) 내부에서 ~ 1.2mm까지 이미지 할 수 있습니다. 따라서 AR-PAM은 해상도는 더 높지만 해상도는 더 낮을 수 있으며 OR-PAM은 매우 높은 해상도로 이미지를 만들 수 있지만 이미지 깊이는 제한적입니다. AR 및 OR-PAM 시스템의 이미징 속도는 주로 레이저 소스 ( 27) 의 펄스 반복 속도에 의존한다.
AR-PAM과 OR-PAM을 결합하면 고해상도와 깊은 이미징을 모두 요구하는 어플리케이션에 큰 도움이됩니다. 이 시스템들을 결합하기위한 노력은 거의 없었다. 일반적으로 이미징에는 2 개의 서로 다른 이미징 스캐너가 사용되므로 샘플을 두 시스템간에 이동해야하므로 생체 내 이미징을 수행하기가 어렵습니다. 그러나 AR 및 OR PAM 모두를 사용한 하이브리드 이미징을 사용하면 확장 가능한 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다.깊이. 하나의 접근법에서, AR 및 OR PAM 모두에 광을 전달하기 위해 광섬유 번들이 사용된다. 이 접근법에서는 2 개의 개별 레이저 (AR의 경우 570 nm의 고 에너지 레이저와 OR의 경우 532 nm의 저에너지, 높은 반복 속도의 레이저)가 사용되어 시스템이 불편하고 고비용이되었습니다. OR-PAM 레이저 파장은 고정되어 있으며 산소 포화도와 같은 많은 연구는이 결합 시스템을 사용하여 가능하지 않습니다. AR과 OR PAM 사이의 비교 연구는 AR과 OR 사이의 레이저 파장 차이 때문에 가능하지 않습니다. 또한 AR-PAM은 명 시야 조명을 사용합니다. 따라서 피부 표면의 강력한 광 음향 신호가 이미지 품질을 제한합니다. 이러한 이유로이 시스템은 많은 바이오 이미징 응용 프로그램에 사용할 수 없습니다. AR 및 OR PAM을 수행하는 또 다른 접근법에서는 광학 및 초음파 초점이 이동되어 광 초점 및 초음파 초점이 정렬되지 않습니다. 따라서 이미지 품질이 최적이 아닙니다. <sup class = "xref"> 29. 이 기술을 사용하여 AR-PAM 및 OR-PAM은 각각 139 μm 및 21 μm의 해상도를 얻을 수 있기 때문에 해상도가 낮은 시스템입니다. 광섬유 및 시준 광학을 변경하는 것을 포함하는 또 다른 접근 방식은 AR과 OR PAM 사이를 전환하여 정렬 프로세스를 어렵게 만드는 것으로보고되었습니다 30 . 이 모든 경우에 AR-PAM은 암시 야 조명을 사용하지 않았습니다. 암시 야 조명을 사용하면 피부 표면에서 강한 광 음향 신호가 생성되는 것을 줄일 수 있습니다. 따라서 깊은 광 음향 신호의 검출 감도가 명 시야 조명의 감도보다 높기 때문에 링 모양의 조명을 사용하여 심 조직 촬영을 수행 할 수 있습니다.
이 연구는 동일한 레이저 및 스캐너를 사용하여 동일한 샘플을 고해상도 이미징 및 저해상도 심 조직 이미징이 가능한 전환 가능한 AR 및 OR PAM (AR-OR-PAM) 이미징 시스템을보고합니다.ems. AR-OR-PAM 시스템의 성능은 가상 실험을 사용하여 공간 해상도와 영상 깊이를 결정함으로써 특성화되었습니다. 생체 내 혈액 vasculature 이미징은 생물 학적 이미징 능력을 입증하기 위해 마우스 귀에 수행되었습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
결론적으로, 낮은 이미징 깊이에서 고해상도 이미징과 높은 이미징 깊이에서 저해상도 이미징을 모두 수행 할 수있는 전환 가능한 AR 및 OR PAM 시스템이 개발되었습니다. 전환 가능한 시스템의 측 해상도와 영상 깊이가 결정되었습니다. 이 전환 가능한 PAM 시스템의 장점은 다음과 같습니다. (1) 엄격한 광학 초점을 사용하는 고해상도 이미징. (2) 음향 집속을 이용한 심 조직 영상; 3) 강력한 PA 신호?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 싱가포르 교육부 (ARC2 / 15 : M4020238)에서 후원하는 Tier 2 교부금에 대한 재정 지원을 인정하고자합니다. 저자는 Machine Shop의 도움을 주신 Chow Wai Hoong Bobby에게 감사드립니다.
Materials
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
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