Umschaltbare akustische und optische Auflösung Photoakustische Mikroskopie für<em> In vivo</em> Kleintier-Blut-Vaskulatur-Bildgebung
Summary
Hier wird eine umschaltbare akustische Auflösung (AR) und eine optische Auflösung (OR) photoakustische Mikroskopie (AR-OR-PAM) -System gezeigt, die sowohl eine hochauflösende Bildgebung in flacher Tiefe als auch eine niedrige Auflösung der tiefen Gewebeabbildung auf der gleichen Probe in vivo ermöglicht .
Abstract
Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist eine schnell wachsende Invivo- Imaging-Modalität, die sowohl Optik als auch Ultraschall kombiniert und so eine Durchdringung über den optischen Mittelweg (~ 1 mm in der Haut) mit hoher Auflösung ermöglicht. Durch die Kombination von optischem Absorptionskontrast mit der hohen räumlichen Auflösung von Ultraschall in einer einzigen Modalität kann diese Technik tiefes Gewebe durchdringen. Photoakustische Mikroskopie-Systeme können entweder eine niedrige akustische Auflösung und Sonde tief oder eine hohe optische Auflösung und Sonde flach haben. Es ist anspruchsvoll, eine hohe räumliche Auflösung und eine große Tiefendurchdringung mit einem einzigen System zu erreichen. Diese Arbeit stellt ein AR-OR-PAM-System dar, das sowohl hochauflösende Bildgebung in flachen Tiefen als auch in einer niederauflösenden Tiefgewebe-Bildgebung der gleichen Probe in vivo ermöglicht . Eine laterale Auflösung von 4 μm mit 1,4 mm Bildtiefe mittels optischer Fokussierung und einer lateralen Auflösung von 45 μm mit 7,8 mm Bildtiefe mittels akustischer Fokussierung waren erfolgreichMit dem kombinierten System demonstriert. Hier wird in vivo eine kleine Tier-Blutgefäß-Bildgebung durchgeführt, um ihre biologische Abbildungsfähigkeit zu demonstrieren.
Introduction
Hochauflösende optische Bildgebungsmodalitäten wie optische Kohärenztomographie, konfokale Mikroskopie und Multiphotonenmikroskopie haben zahlreiche Vorteile. Die räumliche Auflösung nimmt jedoch deutlich ab, wenn die Bildgebungstiefe zunimmt. Dies liegt an der diffusen Natur des Lichttransports in Weichgeweben 1 , 2 . Die Integration von optischer Anregung und Ultraschall-Erkennung bietet eine Lösung, um die Herausforderung der hochauflösenden optischen Bildgebung in tiefen Geweben zu überwinden. Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist eine solche Modalität, die eine tiefere Bildgebung bieten kann als andere optische Bildgebungsmodalitäten. Es wurde erfolgreich auf in vivo strukturelle, funktionelle, molekulare und zellbildende Bildgebung 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 angewendet </sup> , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Studien durch Kombination des starken optischen Absorptionskontrastes mit der hohen räumlichen Auflösung von Ultraschall.
In PAM bestrahlt ein kurzer Laserpuls das Gewebe / die Probe. Die Absorption von Licht durch Chromophore ( zB Melanin, Hämoglobin, Wasser etc. ) führt zu einer Temperaturerhöhung, was wiederum zur Erzeugung von Druckwellen in Form von akustischen Wellen (photoakustische Wellen) führt. Die erzeugten photoakustischen Wellen können durch einen Breitband-Ultraschallwandler außerhalb der Gewebegrenze detektiert werden. Unter Verwendung einer schwachen optischen und engen akustischen Fokussierung kann eine tiefe Gewebeabbildung in der akustischen Auflösung der photoakustischen Mikroskopie (AR-PAM) 14 , 15 , 16 erreicht werden . In AR-PAM, eine laterale Auflösung von 45 μm und eine Abbildungstiefe bis zu 3 mm wurden gezeigt 15 . Um akustisch einzelne Kapillaren (~ 5 μm) aufzulösen, sind Ultraschallwandler erforderlich, die bei> 400 MHz Zentralfrequenzen arbeiten. Bei solchen hohen Frequenzen beträgt die Eindringtiefe weniger als 100 μm. Das durch enge akustische Fokussierung verursachte Problem kann durch eine enge optische Fokussierung gelöst werden. Die optische Auflösung der photoakustischen Mikroskopie (OR-PAM) ist in der Lage, einzelne Kapillaren oder sogar eine einzelne Zelle 17 aufzulösen und eine laterale Auflösung von 0,5 μm wurde erreicht 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Die Verwendung eines photonischen Nanojet kann dazu beitragen, eine Auflösung über die beugungsbegrenzte Resolutio hinaus zu erreichenN 25 , 26 . Bei OR-PAM ist die Eindringtiefe durch Lichtfokussierung begrenzt und kann bis zu ~ 1,2 mm im Inneren des biologischen Gewebes 23 abbilden. Daher kann AR-PAM tiefer abbilden, aber mit einer niedrigeren Auflösung und OR-PAM kann mit einer sehr hohen Auflösung abbilden, aber mit begrenzter Bildtiefe. Die Abbildungsgeschwindigkeit des AR- und OR-PAM-Systems hängt hauptsächlich von der Pulswiederholrate der Laserquelle 27 ab .
Die Kombination von AR-PAM und OR-PAM wird für Anwendungen, die sowohl eine hohe Auflösung als auch eine tiefere Bildgebung erfordern, von großem Nutzen sein. Es wurde wenig Anstrengung unternommen, um diese Systeme zusammen zu kombinieren. In der Regel werden zwei verschiedene bildgebende Scanner für die Bildgebung verwendet, was erfordert, dass die Probe zwischen beiden Systemen bewegt wird, wodurch es schwierig wird, eine in vivo- Bildgebung durchzuführen. Allerdings ermöglicht die Hybrid-Bildgebung mit AR und OR PAM die Abbildung mit skalierbaren Auflösungen aTiefen. Bei einem Ansatz wird ein optisches Faserbündel verwendet, um Licht sowohl für das AR als auch das ODER-PAM zu liefern. Bei diesem Ansatz werden zwei getrennte Laser (ein hochenergetischer Laser bei 570 nm für den AR und ein niederenergetischer Hochfrequenz-Laser mit 532 nm für das ODER) verwendet, wodurch das System unpraktisch und teuer ist. Die ODER-PAM-Laserwellenlänge ist fixiert, und viele Studien, wie z. B. bei der Sauerstoffsättigung, sind mit diesem kombinierten System nicht möglich. Vergleichende Untersuchungen zwischen AR und OR PAM sind auch wegen der Differenz der Laserwellenlängen zwischen AR und OR nicht möglich. Darüber hinaus verwendet AR-PAM eine helle Feldbeleuchtung; Daher beeinflussen starke photoakustische Signale von der Hautoberfläche die Bildqualität. Aus diesem Grund kann das System nicht für viele Bioimaging-Anwendungen eingesetzt werden. In einem anderen Ansatz, um AR und OR PAM durchzuführen, wird der optische und Ultraschallfokus verschoben, was den Lichtfokus und den Ultraschallfokus unausgelegt macht. Damit ist die Bildqualität nicht optimal <suP class = "xref"> 29. Unter Verwendung dieser Technik können das AR-PAM und das OR-PAM nur 139 & mgr; m bzw. 21 & mgr; m Auflösungen erreichen, was es zu einem System mit schlechter Auflösung macht. Ein anderer Ansatz, der das Ändern der optischen Faser und der Kollimationsoptik beinhaltet, wurde berichtet, um zwischen AR und OR PAM umzuschalten, was den Ausrichtungsprozess schwierig macht 30 . In all diesen Fällen verwendete AR-PAM keine Dunkelfeldbeleuchtung. Die Verwendung von Dunkelfeldbeleuchtung kann die Erzeugung von starken photoakustischen Signalen von der Hautoberfläche reduzieren. Daher kann die Tiefgewebe-Bildgebung unter Verwendung einer ringförmigen Beleuchtung durchgeführt werden, da die Erfassungsempfindlichkeit von tiefen photoakustischen Signalen höher ist als bei der Hellfeldbeleuchtung.
Diese Arbeit berichtet über ein umschaltbares AR- und OR-PAM- (AR-OR-PAM) -Bildgebungssystem, das sowohl hochauflösende Bildverarbeitung als auch eine hochauflösende Tiefgewebe-Bildgebung der gleichen Probe mit dem gleichen Laser und Scanner für beide syst möglich istEms Die Leistung des AR-OR-PAM-Systems wurde durch die Bestimmung der räumlichen Auflösung und der Abbildungstiefe durch Phantom-Experimente charakterisiert. In vivo wurde die Blutgefäßbildgebung an einem Mausohr durchgeführt, um seine biologische Abbildungsfähigkeit zu demonstrieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abschließend wurde ein umschaltbares AR- und OR-PAM-System entwickelt, das sowohl eine hochauflösende Bildgebung bei niedrigeren Bildtiefen als auch eine niedrigere Auflösung bei höheren Bildtiefen erreichen kann. Die laterale Auflösung und die Bildgebungstiefe des schaltbaren Systems wurde bestimmt. Die Vorteile dieses schaltbaren PAM-Systems sind: (1) die hochauflösende Bildgebung mit enger optischer Fokussierung; (2) die Tiefgewebe-Bildgebung mittels akustischer Fokussierung; 3) die Dunkelfeldbeleuchtung für A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung aus einem von dem Bildungsministerium in Singapur geförderten Tier 2-Stipendium anerkennen (ARC2 / 15: M4020238). Die Autoren danken auch Herrn Chow Wai Hoong Bobby für den Maschinenladen helfen.
Materials
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
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