切り替え可能な音響光学分解能光音響顕微鏡<em>インビボ</em>小動物の血管系イメージング
Summary
ここでは、インビボで同じ試料上の浅い深度での高分解能画像化と低分解能深部組織画像化の両方が可能な切り替え可能な音響分解能（AR）および光学分解能（OR）光音響顕微鏡法（AR-OR-PAM）
Abstract
光音響顕微鏡法（PAM）は、オプティクスと超音波の両方を組み合わせた高速成長型のインビボイメージングモダリティであり、光学的平均自由行程（肌で1mm以下）を超えて高分解能で侵入します。単一のモダリティで超音波の高空間分解能と光吸収コントラストを組み合わせることにより、この技術は深部組織に浸透することができます。光音響顕微鏡検査システムは、音響分解能が低く、プローブが深く、または光学分解能が高く、プローブが浅くてもよい。単一のシステムで高い空間分解能と深度の浸透を達成することは困難です。この研究は、浅い深度での高解像度イメージングとインビボでの同じサンプルの低解像度深部組織イメージングの両方が可能なAR-OR-PAMシステムを提示する。光学集束を用いた1.4mmの撮像深度を有する4μmの横分解能と、音響集束を用いた7.8mmの撮像深度を有する45μmの横分解能が成功した組み合わせたシステムを使って実証されました。ここで、生体内での小動物の血管系画像化を行って、その生物学的イメージング能力を実証する。
Introduction
光干渉断層撮影法、共焦点顕微鏡法、および多光子顕微鏡法などの高分解能光画像化様式は、多数の利点を有する。しかしながら、空間分解能は、撮像深度が増加するにつれて著しく減少する。これは、軟組織1,2における光輸送の拡散性のためである。光励起と超音波検出の統合は、深部組織における高解像度光学イメージングの課題を克服する解決策を提供する。光音響顕微鏡（PAM）は、他の光学イメージング様式よりも深いイメージングを提供することができるそのような様相の1つである。これは、インビボの構造的、機能的、分子的および細胞イメージングに首尾よく適用されている3,4,5,6,7,8 </sup強い光学吸収コントラストと超音波からの高空間分解能とを組み合わせることにより、 > 9,10,11,12,13の研究を行った。
PAMでは、短いレーザーパルスが組織/試料を照射する。発色団（ 例えば、メラニン、ヘモグロビン、水など ）による光の吸収は、温度上昇をもたらし、その結果、音響波（光音響波）の形態の圧力波が生成される。生成された光音響波は、組織境界外の広帯域超音波変換器によって検出することができる。弱い光学的およびタイトな音響集束を利用して、深部組織撮像は音響解像度光音響顕微鏡（AR-PAM）14,15,16において達成することができる。 ARでは-PAM、45μmの横方向分解能、3mmまでの撮像深度が実証されている15 。単一毛細管（約5μm）を音響的に解決するためには、> 400MHzの中心周波数で動作する超音波トランスデューサが必要である。このような高い周波数では、侵入深さは100μm未満である。タイトな光学的集束を使用して、密着した音響集束によって生じる問題を解決することができる。光学的解像度光音響顕微鏡法（OR-PAM）は、単一の毛細血管または単一の細胞17を分解することができ、0.5μmの横方向分解能は18,19,20,21,22,23,24に達している。フォトニックナノジェットの使用は、回折限界解像度以上の解像度を達成するのに役立ちますn 25,26 。 OR-PAMでは、光の集束のために侵入深さが制限され、生物組織23の内部で約1.2mmまで撮像することができる。従って、AR-PAMはより深く、より低い解像度で画像を形成することができ、OR-PAMは、非常に高い解像度で画像化することができるが、画像深度は限られる。 AR及びOR-PAMシステムの画像化速度は、主として、レーザ光源27のパルス繰り返し速度に依存する。
AR-PAMとOR-PAMを組み合わせることは、高解像度と深い画像の両方を必要とするアプリケーションに大きな利点となります。これらのシステムを組み合わせるための努力はほとんどなされていない。通常、2つの異なるイメージングスキャナがイメージングに使用され、これはサンプルが両方のシステム間を移動することを必要とし、したがってインビボイメージングを実行することを困難にする。しかしながら、AR及びOR PAMの両方を用いたハイブリッド撮像は、スケーラブルな解像度深さ。 1つのアプローチでは、ARおよびOR PAMの両方の光を送達するために光ファイババンドルが使用される。このアプローチでは、2つの別々のレーザー（ARの場合は570 nmの高エネルギーレーザーとORの場合は532 nmの低エネルギー、高繰り返しレーザー）が使用され、システムが不便で高価になります。 OR-PAMレーザーの波長は固定されており、酸素飽和度などの多くの研究は、この複合システムを使用しては不可能です。 ARとOR PAMとの比較研究は、ARとORとの間のレーザ波長の違いのためにも不可能である。さらに、AR-PAMは明視野照明を使用する。したがって、皮膚表面からの強い光音響信号が画質を制限する。このため、このシステムは多くのバイオイメージングアプリケーションには使用できません。 ARおよびOR PAMを実行する別の手法では、光学的および超音波的な焦点がシフトされ、光の焦点および超音波の焦点の位置合わせが不整合になる。したがって、画質は最適ではない<sup class = "xref"> 29。この技術を使用すると、AR-PAMおよびOR-PAMは、それぞれ139μmおよび21μmの分解能しか達成できず、分解能の低いシステムになります。光ファイバーとコリメート光学系を変更することを含むもう1つのアプローチは、ARとOR PAMの間で切り替えることが報告されています。これらのすべての場合において、AR-PAMは暗視野照明を使用しなかった。暗視野照明の使用は、皮膚表面からの強い光音響信号の生成を低減することができる。したがって、深い光音響信号の検出感度が明視野照明の検出感度に比べて高いので、リング状照明を用いて深部組織撮像を行うことができる。
この研究は、両方の嚢に対して同じレーザーとスキャナーを使用して、同じサンプルの高分解能イメージングと低分解能深部組織イメージングの両方が可能な切り替え可能なARおよびOR PAM（AR-OR-PAM）イメージングシステムを報告していますems。 AR-OR-PAMシステムの性能は、ファントム実験を用いて空間分解能および画像深度を決定することによって特徴付けられた。 インビボでの血液血管造影画像をマウスの耳に対して実施して、その生物学的イメージング能力を実証した。
Protocol
Representative Results
Discussion
結論として、より低いイメージング深度で高解像度イメージングとより高いイメージング深度で低解像度イメージングの両方を達成できる切り替え可能なARおよびOR PAMシステムが開発された。切り換え可能なシステムの横方向分解能および画像深度が決定された。この切り替え可能なPAMシステムの利点は、（1）きつい光学的集束を使用する高解像度イメージング、 （2）音響集束を用いた深?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、シンガポールの教育省（ARC2 / 15：M4020238）が資金を提供するTier 2助成金からの財政的支援を認めたいと考えています。著者は機械ショップの助けを借りてChow Wai Hoong Bobbyに感謝したいと思います。
Materials
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
- Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
- Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
- Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
- Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
- Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
- Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
- Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
- Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
- Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
- Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
- Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
- Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
- Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
- Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
- Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
- Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
- Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
- Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
- Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
- Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
- Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
- Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
- Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
- Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
- Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
- Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
- Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
- Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
- Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
- Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic – resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
- Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
- Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
- . ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , (2000).
- Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).
