Overvågning af ER / SR-calciumfrigivelse med den målrettede Ca<sup> 2+</sup> Sensor CatchER<sup> +</sup
Summary
Vi præsenterer protokoller til anvendelse af vores målrettede genetisk kodede calciumindikator (GECI) CatchER + til overvågning af hurtige calciumtransienter i det endoplasmatiske / sarkoplasmiske retikulum (ER / SR) af HEK293 og skeletmuskulatur C2C12-celler ved hjælp af realtids fluorescensmikroskopi. En protokol til in situ K d måling og kalibrering diskuteres også.
Abstract
Intracellulære calcium (Ca 2+ ) transienter fremkaldt af ekstracellulære stimuli initierer en lang række biologiske processer i levende organismer. I centrum for intracellulær calciumfrigivelse er de vigtigste intracellulære calciumlagringsorganeller, det endoplasmatiske retikulum (ER) og det mere specialiserede sarkoplasmiske retikulum (SR) i muskelceller. Den dynamiske frigivelse af calcium fra disse organeller medieres af ryanodinreceptoren (RyR) og inositol 1,4,5-triphosphatreceptoren (IP 3 R) med genopfyldning, der forekommer gennem sarco / endoplasmatisk reticulum calcium-ATPase (SERCA) -pumpen. En genetisk kodet calciumsensor (GECI) kaldet CatchER blev oprettet for at overvåge den hurtige calciumfrigivelse fra ER / SR. Her er de detaljerede protokoller til transfektion og ekspression af den forbedrede, ER / SR-målrettede GECI CatchER + i HEK293- og C2C12-celler og dens anvendelse til overvågning af IP3R-, RyR- og SERCA-pumpemedieret calciumtransientS i HEK293-celler ved anvendelse af fluorescensmikroskopi er skitseret. Den valgte receptoragonist eller inhibitor er dispergeret i kammeropløsningen, og intensitetsændringerne registreres i realtid. Med denne metode ses et fald i ER-calcium med RyR-aktivering med 4-chlor-m-cresol (4 cmc), den indirekte aktivering af IP 3 R med adenosintrifosfat (ATP) og hæmning af SERCA-pumpen med cyclopiazon Syre (CPA). Vi diskuterer også protokoller til bestemmelse af in situ K d og kvantificering af basal [Ca 2+ ] i C2C12 celler. Sammenfattende kan disse protokoller, der anvendes sammen med CatchER + , fremkalde receptormedieret calciumfrigivelse fra ER med fremtidig anvendelse ved undersøgelse af ER / SR-calciumrelaterede patologier.
Introduction
De spatio-temporale attributter af intracellulære calcium (Ca 2+ ) transienter aktiverer forskellige biologiske funktioner 1 . Disse Ca 2+ signaleringshændelser udløses ekstracellulært gennem forskellige stimuli og kontrolleres intracellulært af den store Ca 2+ opbevaringsorganelle og ved adskillige Ca 2+ pumper, kanaler og Ca 2+ bindingsproteiner. Ca 2+ transienter kan ændres væsentligt som følge af defekter med signalmodulation, hvilket fører til forskellige sygdomme 2 . På grund af hastigheden og kompleksiteten af Ca 2+ -signaleringssystemet, med endo- (ER) og sarkoplasmisk retikulum (SR) i midten, er der behov for genetisk kodede Ca 2+ prober, som er optimeret til pattedyrsekspression med hurtig kinetik. At observere globale og lokale Ca 2+ ændringer i forskellige celler 3 .
ER og SR, Dens modsætning i muskelceller, er de vigtigste intracellulære Ca 2+ opbevaringsorganeller og fungerer som Ca 2+ dræn, der hjælper med at forstærke Ca 2+ -signalet 4 . ER / SR er en integreret del i Ca 2+ -signalering med dobbelte roller som en sender og modtager af signaler 5 . Ryanodinreceptoren (RyR) og inositol-1,4,5-triphosphatreceptoren (IP 3 R) er Ca 2+ -frigivelsesreceptorer placeret på membranerne i ER / SR, som er reguleret af Ca 2+ 6 . Andre midler stimulerer direkte eller indirekte funktionen af disse receptorer. 4-chlor-m-cresol (4-cmc) er en potent agonist af RyR, der har en 10 gange højere følsomhed end koffein til induktion af SR Ca 2+ -frigivelse, hvor begge jævnligt anvendes til at studere RyR-medieret Ca 2+ -frigivelse i Sunde og syge celler 7 . ATP forøger IP3-medieret Ca2 + reLeasing gennem IP 3 R 8 . ATP binder til den purinergreceptor P2YR, en G-proteinkoblet receptor (GPCR), der udløser produktionen af IP3, der binder til IP3R for at frigive Ca2 + fra ER 9 , 10 . Seraco-endoplasmatiske reticulum-calcium ATPase-pumpen (SERCA) er en P-type ATPase-pumpe, der også er placeret på ER / SR-membranen, som reducerer cytosolisk Ca2 + og refiller ER / SR ved aktivt at pumpe ionet i ER / SR-lumen 11 . Specifikke hæmmere af SERCA-pumpen omfatter thapsigargin, fra Thapsia garganica og cyclopiazonsyre (CPA), fra Aspergillus og Penicillium . CPA har en lav affinitet for pumpen og blokkerer reversibelt Ca 2+ adgangspunktet 12 . Thapsigargin binder på den anden side irreversibelt til Ca 2+ fri pumpe ved rest F256 i M3-helixen med nanomolAr affinitet 11 . Analyse og kvantificering af ændringerne involveret i Ca 2+ stimulerede hændelser har været og forbliver en udfordring. Da ER / SR er det store subcellulære Ca 2+ indeholdende rum med en central funktion i udbredelsen af Ca 2+ signalet, har meget arbejde været fokuseret på at forstå ER / SR Ca 2+ signalering 5 .
Oprettelsen af syntetiske Ca 2+ farvestoffer hjalp med at fremme feltet og praksis med Ca 2+ billeddannelse. Selvom farvestoffer, såsom Mag-Fura-2, i vid udstrækning er blevet brugt til at måle rummere Ca 2+ i forskellige celler, har de 13 , 14 , 15 begrænsninger som ujævn farvestofbelastning, fotoblegning og manglende evne til at blive målrettet mod specifikke organeller . Opdagelsen af det grønne fluorescerende protein (GFP) og fremskridtet af fluorescerende protein-Baserede Ca 2+ prober har fremdrevet feltet Ca 2+ billeddannelse fremad 16 . Nogle af de eksisterende GECI'er er Förster resonans energioverførsel (FRET) par, der involverer gul fluorescerende protein (YFP), cyan fluorescerende protein (CFP), calmodulin og M13 bindende peptid 17 , 18 . Troponin C-baserede GECI'er er også tilgængelige som FRET-par CFP og Citrin og som enkeltfluoroforprober 19 , 20 , 21 . Andre, såsom GCaMP2 og R-GECO, er single fluorophore sensorer involverende calmodulin 22 , 23 . For at overvinde begrænsningerne af smal afstemning af K d' er og kooperativ binding forbundet med flere Ca 2+ bindingssteder fundet i deres Ca 2+ bindingsdomæner 24 , en ny klasse af calcium senSors blev skabt ved at designe et Ca 2+ bindingssted på overfladen af beta tønde i en kromofor-følsom placering af forbedret grønt fluorescerende protein (EGFP) 25 , 26 . Denne stærkt spionerede sensor, kaldet CatchER, har en Kd på ~ 0,18 mM, ak ved nær diffusionsgrænsen og ak off på 700 s -1 . CatchER er blevet anvendt til at overvåge receptor-medieret ER / SR-calciumfrigivelse i forskellige pattedyrcellelinjer, såsom HeLa, HEK293 og C2C1225. På grund af sin hurtige kinetik blev CatchER anvendt i flexor digitorum brevis (FDB) muskelfibre af unge og gamle Friend Virus B NIH Jackson (FVB) mus for at afsløre, at mere Ca 2+ forbliver i SR efter 2 s depolarisering i FDB Fibre af gamle mus sammenlignet med hos unge mus 27 . For at overvinde dens lave fluorescens ved 37 ° C, hvilket forhindrer dets anvendelser ved calciumbilleddannelse af pattedyrCeller, har vi udviklet en forbedret version af CatchER kaldet CatchER + . CatchER + udviser forbedret fluorescens ved 37 ° C til bedre anvendelse i pattedyrsceller. Yderligere mutationer blev inkorporeret i CatchER for at forbedre termostabiliteten og fluorescensen ved 37 ° C 28 , 29 for at skabe CatchER + . CatchER + udviser en seks gange stigning i signal-støjforholdet (SNR) over CatchER 30 .
Her præsenteres protokollerne til kulturen og transfektionen af HEK293- og C2C12-celler med CatchER + og dens anvendelse til overvågning af ER / SR-receptor-medierede calciumtransienter. Repræsentative resultater er vist for CatchER + udtrykt i HEK293-celler behandlet med 4 cmc, CPA og ATP. Vi tilvejebringer også en protokol til bestemmelse af in situ K d af CatchER + i C2C12 myoblastceller og quaNtifikation af basal [Ca 2+ ].
Protocol
Representative Results
Discussion
Levende enkeltcellebilleddannelse af fluorescerende prober, såsom CatchER + , er en effektiv teknik til at analysere intrikate ER / SR Ca 2+ signalprocesser i hver celle som reaktion på receptoragonister eller antagonister. Denne teknik er også nyttig til billeddannelse ved anvendelse af flere bølgelængder samtidigt, som det er nødvendigt for Fura-2 eller til image CatchER + og Rhod-2 sammen for at overvåge henholdsvis henholdsvis ER- og cytosolisk calciumændringer. Der er flere …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant og en NIH Supplementary Grant til FR, BB-stipendium til CM, CDT-fællesskab til RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. . Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. . Calcium signaling protocols. , (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).
