Hedeflenen Ca ile ER / SR Kalsiyum Salınımının İzlenmesi<sup> 2+</sup> Sensör Catcher<sup> +</sup
Summary
HEK293'ün endoplazmik / sarkoplazmik retikulumdaki (ER / SR) hızlı kalsiyum geçişlerini ve gerçek zamanlı floresan mikroskopisi kullanarak iskelet kası C2C12 hücrelerini izlemek için hedeflenmiş genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesi (GECI) Catcher + 'ün uygulanması için protokoller sunuyoruz. Yerinde K d ölçümü ve kalibrasyonu için bir protokol de tartışılmıştır.
Abstract
Hücre dıĢı uyaranlar tarafından uyarılan hücre içi kalsiyum (Ca2 + ) geçicileri canlılarda çok sayıda biyolojik proses başlatır. Hücre içi kalsiyum salınımının merkezinde, kas hücrelerinde büyük hücreiçi kalsiyum depolama organelleri, endoplazmik retikulum (ER) ve daha özelleşmiş sarkoplazmik retikulum (SR) bulunur. Bu organellerden kalsiyumun dinamik olarak salınması, sarko / endoplasmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası vasıtasıyla yeniden doldurma ile birlikte riyano-nodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R) aracılığı ile sağlanır. ER / SR'den hızlı kalsiyum salımını izlemek için, Catcher adı verilen, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum sensörü (GECI) oluşturuldu. Burada, HEK293 ve C2C12 hücrelerinde gelişmiş ER / SR hedef GECI Catcher + 'ın transfeksiyonu ve ekspresyonu için ayrıntılı protokoller ve IP 3 R, RyR ve SERCA pompa aracılıklı kalsiyum geçiciHEK293 hücrelerinde floresan mikroskobu kullanılarak özetlenmiştir. Seçilen reseptör agonisti veya inhibitörü oda çözeltisine dağıtılır ve yoğunluk değişiklikleri gerçek zamanlı olarak kaydedilir. Bu yöntemle, ER kalsiyumunda bir azalma, 4-kloro-m-kresol (4-cmc), adenosin trifosfat (ATP) ile dolaylı olarak IP 3 R'yi aktive eden RyR aktivasyonu ve siklopiazonik SERCA pompasının inhibisyonu ile görülür Asit (CPA). Ayrıca in situ K d' yi belirlemek ve C2C12 hücrelerinde bazal [Ca 2+ ] miktarını belirlemek için protokolleri tartışıyoruz. Özetle, Catcher + ile birlikte kullanılan bu protokoller ER / SR kalsiyum ile ilgili patolojilerin incelenmesinde gelecekte uygulanacak olan ER'den reseptör aracılı kalsiyum salımını ortaya çıkarabilir.
Introduction
Hücre içi kalsiyum (Ca 2+ ) geçici maddelerinin uzay-zamansal özellikleri, çeşitli biyolojik fonksiyonları aktive eder 1 . Bu Ca 2+ sinyal olayları hücre dışı olarak farklı uyarılarla tetiklenir ve hücre içi olarak büyük Ca 2+ depolama organelleri ve sayısız Ca 2+ pompalar, kanallar ve Ca 2+ bağlayıcı proteinler tarafından kontrol edilir. Ca 2+ transientleri, sinyal modülasyonlu kusurların bir sonucu olarak farklı hastalıklara yol açarak önemli ölçüde değişebilir 2 . Merkezde endo (ER) ve sarkoplazmik retikül (SR) bulunan Ca 2+ sinyal sisteminin hızı ve karmaşıklığı nedeniyle, hızlı kinetik ile memelilerin ekspresyonu için optimize edilmiş genetik olarak kodlanmış Ca 2+ probları gereklidir Farklı hücrelerdeki küresel ve yerel Ca 2+ değişimlerini gözlemlemek 3 .
ER ve SR, Kas hücrelerindeki muadili, büyük intraselüler Ca 2+ depolama organelleri olup Ca 2+ sinyallerinin amplifiye edilmesine yardımcı olan Ca 2+ lavabo gibi hareket eder. ER / SR, Ca 2+ sinyallerinin ayrılmaz bir parçasıdır ve sinyaller 5 vericisi ve alıcısı olarak ikili rolleri vardır. Riyanodin reseptörü (RyR) ve inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü (IP 3 R), Ca 2+ 6 ile regüle edilen ER / SR membranlarında bulunan Ca 2+ serbest reseptörleridir. Diğer ajanlar doğrudan veya dolaylı olarak bu reseptörlerin işlevini uyarır. 4-kloro-m-kresol (4-cmc), her ikisi de düzenli olarak RyR aracılı Ca 2+ salınımını incelemek için kullanıldığında, SR Ca 2+ salınımını tetiklemek için kafeinden 10 kat daha yüksek bir hassasiyete sahip olan, RyR'nin güçlü bir agonistidir Sağlıklı ve hastalıklı hücreler 7 . ATP, IP 3 aracılı Ca 2+ reIP 3 R 8 üzerinden kiralayın . ATP, bir G-proteine bağlı reseptör (GPCR) olan purinergik reseptör P2YR'ye bağlanır ve IP 3 R'ye bağlanan IP 3 üretimini tetikleyerek Ca 2+ 'yı ER 9 , 10'dan salınır. Sarkoz endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz (SERCA) pompası, aynı zamanda ER / SR zarında bulunan ve sitosolik Ca 2+ miktarını azaltan ve iyonu ER / SR lümenine aktif olarak pompalayarak ER / SR'yi tekrar dolduran bir P tipi ATPaz pompasıdır 11 . SERCA pompasının spesifik önleyicileri, Thapsia garganica'ndan thapsigargin ve Aspergillus ve Penicillium'dan siklopiazonik asit (CPA) içerir . CPA, pompa için düşük afiniteye sahiptir ve Ca 2+ erişim noktasını 12 tersine çevrilebilir şekilde bloke eder. Thapsigargin, diğer yandan, nanomol ile M3 helezonunda F256 kalıntısında Ca 2+ serbest pompaya geri döndürülemez şekilde bağlanırAf affinity 11 . Ca 2+ uyarılmış olaylarla ilgili değişiklikleri analiz etmek ve nicelleştirmek bir sorun olmuştur ve halen bir meydan okuma olmaya devam etmektedir. ER / SR, Ca 2+ sinyalinin yayılımında merkez işlevli ana hücre içi Ca 2+ ihtiva eden kompartıman olduğundan, ER / SR Ca 2+ sinyalizasyonunu anlama konusunda çok çalışılmıştır.
Sentetik Ca 2 + boyalarının oluşturulması, Ca 2+ görüntülemenin tarla ve uygulamasına yardımcı olmuştur. Mag-Fura-2 gibi boyalar, farklı hücrelerdeki bölümlü Ca 2+ miktarını ölçmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, 13 , 14 , 15 düzensiz boya yüklemesi, foto-ağartma ve belirli organelleri hedef alamama gibi sınırlamaları vardır . Yeşil floresan protein (GFP) keşfi ve floresan protein-Tabanlı Ca 2+ sondaları Ca 2+ görüntüleme alanını ilerletti 16 . Mevcut GECI'lerin bazıları sarı floresan protein (YFP), camgöbeği flüoresan proteini (CFP), kalmodulin ve M13 bağlayıcı peptid 17 , 18 içeren Förster rezonans enerji transferi (FRET) çiftleri. Troponin C tabanlı GECI'ler, FRET'in CFP ve Sitrin çiftleri olarak ve tekli florofor probları 19 , 20 , 21 olarak da mevcuttur. GCaMP2 ve R-GECO gibi diğerleri, kalmodulin 22 , 23 içeren tekli florofor sensörleridir. Ca2 + bağlanma alanlarında 24 bulunan çoklu Ca2 + bağlanma yerleri ile ilişkili Kd ve kooperatif bağlamanın dar ayarlamanın sınırlamalarını aşmak için yeni bir kalsiyum sınıfı sınıfıSors, gelişmiş yeşil flüoresan protein (EGFP) 25 , 26'nın kromofor duyarlı bir konumunda beta varilin yüzeyinde Ca2 + bağlama sitesi tasarlanarak oluşturuldu. CatchER olarak adlandırılan bu yüksek duyarlıklı sensör, ~ 0,18 mM'lik bir Kd'ye, difüzyon sınırının yakınında ak'a ve 700 s'lik bir ak'a sahiptir. Catcher, HeLa, HEK293 ve C2C12 25 gibi farklı memeli hücre dizilerinde reseptör aracılı ER / SR kalsiyum salımını izlemek için kullanılmıştır. Hızlı kinetiklerinden dolayı Catcher, genç ve yaşlı Friend Virüs B NIH Jackson (FVB) farelerinin flexor digitorum brevis (FDB) kas liflerinde FDB'de 2 s depolarizasyon sonrasında SR'de daha fazla Ca 2+ kalmış olduğunu göstermek için kullanıldı Eski farelerin elyafları genç farelerinkine kıyasla 27 . Memelinin kalsiyum görüntülemedeki uygulamalarını engelleyen, 37 ° C'de düşük flüoresansının üstesinden gelmek içinCatcher + denilen Catcher'ın geliştirilmiş bir versiyonunu geliştirdik. Catcher + , memeli hücrelerinde daha iyi uygulama için 37 ° C'de gelişmiş floresan sergilemektedir. 37 ° C'de 28 , 29 ° C'de termostabilite ve flüoresanı iyileştirmek için Catcher + ' e ek mutasyon eklendi. Catcher + , Sinyal-gürültü oranına (SNR) Catcher 30'a göre altı kat arttı.
Burada, Catcher + ile HEK293 ve C2C12 hücrelerinin kültürlenmesi ve transfeksiyonu için protokoller ve ER / SR reseptör aracılı kalsiyum geçişlerini izlemek için uygulanması sunulmuştur. Temsilci sonuçlar, 4 cmc, CPA ve ATP ile muamele edilmiş HEK293 hücrelerinde ifade edilen Catcher + için gösterilmiştir. C2C12 miyoblast hücrelerinde Catcher + in situ K d' sini belirlemek için bir protokol de sunuyoruzBazal [Ca 2+ ] ntifikasyonu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Catcher + gibi flüoresan probların canlı tek hücreli görüntülemesi, reseptör agonistlerine veya antagonistlerine yanıt olarak her bir hücredeki karmaşık ER / SR Ca 2+ sinyalleme süreçlerini analiz etmek için etkili bir tekniktir. Bu teknik, sırasıyla hem ER hem de sitozolik kalsiyum değişikliklerini izlemek için birlikte Fura-2 için veya Catcher + ve Rhod-2 görüntüsü için gerekli olan gibi, aynı anda birden çok dalga boyunu kullanan görüntüleme için de yar…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B Seed Grant tarafından finanse edildi ve NI, FR, BB bursundan CM, CDT bursuna RG'ye bir Yardım Masası ek yardımı ile finanse edildi.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. . Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. . Calcium signaling protocols. , (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).
