ניטור ER / SR סידן שחרור עם CA ממוקד<sup> 2+</sup> חיישן Catcher<sup> +</sup
Summary
אנו מציגים פרוטוקולים ליישום של מחוון סידן מקודד גנטית ממוקד גנטית (GECI) Catcher + לניטור מהיר trans סידן ב reticulum endoplasmic / sarcoplasmic (ER / SR) של HEK293 ו שלד שריר תאים C2C12 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. פרוטוקול למדידה באתרו K d וכיול נדון גם.
Abstract
סידן תאיים (Ca 2 + ) transients עורר על ידי גירויים תאיים ליזום מספר רב של תהליכים ביולוגיים אורגניזמים חיים. במרכזו של שחרור סידן תאיים הם האורגנים הגדולים אחסון סידן תאיים, reticulum endoplasmic (ER) ואת reticulum sarcoplasmic מיוחדים (SR) בתאי שריר. שחרור דינמי של סידן מן האברונים האלה מתווכת על ידי קולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) עם מילוי המתרחשים באמצעות משאבת הסרקו / endoplasmic סידן ATPase (SERCA). חיישן סידן מקודד גנטית (GECI) בשם Catcher נוצר כדי לפקח על שחרור סידן מהיר ER / SR. הנה, פרוטוקולים מפורטים עבור transfection וביטוי של שיפור, ER / SR- ממוקד GECI Catcher + ב HEK293 ו C2C12 תאים ויישומה ניטור IP 3 R, ריר, SERCA משאבת בתיווך סידן חולףS בתאים HEK293 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתואר. קולטן אגוניסט או מעכב של בחירה הוא התפזר פתרון קאמרי ואת השינויים בעוצמה נרשמות בזמן אמת. עם שיטה זו, ירידה סידן ER נראה עם הפעלת ריר עם 4-chloro-m-cresol (4-cmc), ההפעלה העקיפה של IP 3 R עם אדנוזין טריפוספט (ATP), וכן עיכוב של משאבת SERCA עם cyclopiazonic חומצה (CPA). כמו כן, אנו דנים בפרוטוקולים לקביעת באתרו K ב ו לכמת הבסיס [Ca 2 + ] בתאי C2C12. לסיכום, פרוטוקולים אלה, המשמשים יחד עם Catcher + , יכולים לעורר קולטן בתיווך סידן בתיווך עם יישום עתידי בחקר ER / SR סידן פתולוגיות הקשורות.
Introduction
התכונות הספציו-טמפורליות של סידן תאיים (Ca 2 + ) חולפות פונקציות ביולוגיות שונות 1 . אלה Ca 2 + אירועים איתות מופעלות מחוץ לתאי באמצעות גירויים שונים נשלט intracellularly על ידי Ca 2 + האחסון הגדולות אחסון על ידי רבים Ca 2 + משאבות, ערוצים, Ca 2 + חלבונים מחייב. Ca 2 + transients יכול להיות שונה באופן משמעותי כתוצאה של פגמים עם אפנון האות, המוביל למחלות שונות 2 . בגלל המהירות ואת המורכבות של Ca 2 + מערכת איתות, עם endo- (ER) ו sarcoplasmic reticulum (SR) במרכז, גנטית מקודדים Ca 2 + בדיקות כי כבר אופטימיזציה עבור ביטוי יונקים עם קינטיקה מהירה יש צורך כדי לעקוב אחר Ca 2 + המקומי המקומי שינויים בתאים שונים 3 .
ER ו SR, עמיתו בתאי השריר, הם תאיים מרכזי תא Ca 2 + אחסון ולפעול כמו Ca 2 + כיורים המסייעים להגביר את Ca 2 + אות 4 . ER / SR הוא חלק בלתי נפרד Ca 2 + איתות עם תפקידים כפולים כמו משדר מקלט של אותות 5 . הקולטן ryanodine (RyR) ו inositol קולטן 1,4,5-triphosphate (IP 3 R) הם Ca 2 + קולטנים שחרור ממוקם על הקרומים של ER / SR כי מוסדרים על ידי Ca 2 + 6 . סוכנים אחרים במישרין או בעקיפין לעורר את הפונקציה של קולטנים אלה. 4-chloro-m-cresol (4-cmc) הוא אגוניסט חזק של ריר, בעל 10 רגישות גבוהה יותר מאשר קפאין להפקת SR Ca 2 + שחרור שבו שניהם מועסקים באופן קבוע ללמוד RI בתיווך Ca 2 + שחרור ב תאים בריאים וחולים. ATP מגדיל IP 3- מתווכת Ca 2 + מחדשחכירה באמצעות IP 3 R 8 . ATP נקשר לקולטן הפורינרגי P2YR, קולטן G יחד עם ה- GPR, המפעיל את ייצור ה- IP 3 המחובר ל- IP 3 R כדי לשחרר Ca 2 + ממכשיר ה- ER 9 , 10 . המשאבה הסרקו-endoplasmic reticulum סידן ATPase (SERCA) היא משאבת ATPase מסוג P, הממוקמת גם על קרום ER / SR המפחית cytosolic Ca 2 + וממלא את ER / SR על ידי פעיל לשאוב את יון לתוך לומן ER / SR 11 . מעכבים ספציפיים של המשאבה SERCA כוללים thapsigargin, מ Thapsia garganica , וחומצה cyclopiazonic (CPA), מ Aspergillus ו פניציליום . מחיר לרכישה יש זיקה נמוכה עבור המשאבה וחוסמת באופן הפוך את נקודת הגישה 2 + Ca 12 . Thapsigargin, לעומת זאת, באופן בלתי הפיך נקשר המשאבה Ca 2 + חינם ב שאריות F256 ב הסליל M3 עם nanomolז. ניתוח וכימות השינויים הכרוכים Ca 2 + אירועים מגורה כבר ונשאר אתגר. מאז ER / SR הוא תת subcellular מרכזי Ca 2 + המכיל תא עם פונקציה מרכזית בהפצה של האות Ca 2 + , הרבה עבודה כבר התמקדו בהבנה ER / SR Ca 2 + איתות 5 .
יצירת סינתטי Ca 2 + צבעים עזר לקדם את השדה והנוהג של Ca 2 + הדמיה. למרות צבעים, כגון מג-פורה -2, נעשה שימוש נרחב למדידת Ca 2 + תאים בתאים שונים, 13 , 14 , 15 יש להם מגבלות כגון עומס צבע אחיד, photobleaching, ואת חוסר היכולת להיות ממוקד לארגנים ספציפיים . גילוי של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) וקידום של חלבון פלואורסצנטי,מבוסס Ca 2 + בדיקות יש דחף את שדה Ca 2 + הדמיה קדימה 16 . חלק GECIs הקיימים הם Förster תהודה העברת אנרגיה (סריג) זוגות מעורבים חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP), חלבון פלואורסצנטי ציאן (CFP), רמודודולין ואת פפטיד M13 מחייב 17 , 18 . Troponin C מבוססי GECIs זמינים גם כמו זוגות סריג של CFP ו Citrine וכן בדיקות fluorophore יחיד 19 , 20 , 21 . אחרים, כגון GCaMP2 ו- R-GECO הם חיישנים fluorophore יחיד המעורבים רגוע 22 , 23 . כדי להתגבר על המגבלות של כוונון צר של K ד 'ו שיתופית קשורה הקשורים מספר Ca 2 + אתרים מחייב למצוא Ca 2 שלהם + תחומים מחייב 24 , מחלקה חדשנית של סידן סןסורס נוצר על ידי עיצוב Ca 2 + אתר מחייב על פני השטח של חבית ביתא במיקום רגיש chromophore של חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר (EGFP) 25 , 26 . זה חיישן touted, קרא Catcher, יש K d של ~ 0.18 מ"מ, ak על גבול דיפוזיה, ו ak של 700 s -1 . Catcher שימש כדי לפקח על קולטן בתיווך ER / SR סידן לשחרר שורות תאים יונקים שונים כגון HeLa, HEK293, ו C2C12 25 . בגלל הקינטיקה המהירה שלה, Catcher היה בשימוש סיבי שריר מכופף digitorum brevis (FDB) של צעירים וידידים חבר 'ה ב NIH ג' קסון (FVB) עכברים לחשוף כי יותר Ca 2 + נשאר SR לאחר 2 של פוליאוריזציה של FDB סיבי עכברים ישנים בהשוואה לזו של עכברים צעירים 27 . כדי להתגבר על הקרינה נמוכה ב 37 מעלות צלזיוס, אשר מעכב את היישומים שלה הדמיה סידן של יונקיםתאים, פיתחנו גרסה משופרת של Catcher שנקרא Catcher + . Catcher + תערוכות משופרת הקרינה על 37 מעלות צלזיוס ליישום טוב יותר בתאי יונקים. מוטציות נוספות שולבו Catcher כדי לשפר את thermostability ו פלואורסצנטי ב 37 ° C 28 , 29 , כדי ליצור Catcher + . Catcher + מציג עלייה פי שישה ביחס האות לרעש (SNR) מעל Catcher 30 .
כאן, הפרוטוקולים של התרבות transfection של HEK293 ו C2C12 תאים עם Catcher + ויישומו לניטור ER / SR קולטן בתיווך סידן חולפים מוצגים. תוצאות נציג מוצגים עבור Catcher + לידי ביטוי HEK293 תאים שטופלו 4-cmc, CPA ו- ATP. כמו כן, אנו מספקים פרוטוקול לקביעת באתרו K של Catcher + ב C2C12 תאים myoblast ו quaNtification של הבסיס [Ca 2 + ].
Protocol
Representative Results
Discussion
חי בודד תא הדמיה של בדיקות ניאון, כגון Catcher + , היא טכניקה יעילה לנתח מסובך ER / SR Ca 2 + תהליכי איתות בכל תא בתגובה אגוניסטים קולטן או אנטגוניסטים. טכניקה זו שימושית גם עבור הדמיה תוך שימוש באורכי גל מרובים בו זמנית, כגון הצורך Fura-2 או תמונה Catcher + ו Rhod-2 יחד כ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי NIH GM62999, NIH EB007268, NIH AG15820, B & B זרע גרנט, וכן מענק משלים NIH כדי FR, אחוות BB ל CM, המלגה CDT ל RG.
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1 (1), 11-21 (2000).
- Berridge, M. J. Calcium signalling remodelling and disease. Biochem. Soc. Trans. 40, 297-309 (2012).
- Tang, S., Reddish, F., Zhuo, Y., Yang, J. J. Fast kinetics of calcium signaling and sensor. Curr. Opin. Chem. Biol. 27, 90-97 (2015).
- Rizzuto, R., Pozzan, T. Microdomains of intracellular Ca2+: Molecular determinants and functional consequences. Physiol. Rev. 86 (1), 369-408 (2006).
- Berridge, M. J. The endoplasmic reticulum: a multifunctional signaling organelle. Cell Calcium. 32 (5-6), 235-249 (2002).
- Clapham, D. E. Calcium Signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
- HerrmannFrank, A., Richter, M., Sarkozi, S., Mohr, U., LehmannHorn, F. 4-chloro-m-cresol, a potent and specific activator of the skeletal muscle ryanodine receptor. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1289 (1), 31-40 (1996).
- Ferris, C. D., Huganir, R. L., Bredt, D. S., Cameron, A. M., Snyder, S. H. Inositol trisphosphate receptor: phosphorylation by protein kinase C and calcium calmodulin-dependent protein kinases in reconstituted lipid vesicles. Proc. Natl. Acad. Sci. 88 (6), 2232-2235 (1991).
- Dubyak, G. R., el-Moatassim, C. Signal transduction via P2-purinergic receptors for extracellular ATP and other nucleotides. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 265 (3 Pt 1), C577-C606 (1993).
- Song, Z., Vijayaraghavan, S., Sladek, C. D. ATP increases intracellular calcium in supraoptic neurons by activation of both P2X and P2Y purinergic receptors. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 292 (1), R423-R431 (2007).
- Brini, M., Carafoli, E. Calcium Pumps in Health and Disease. Physiol. Rev. 89 (4), 1341-1378 (2009).
- Michelangeli, F., East, J. M. A diversity of SERCA Ca2+ pump inhibitors. Biochem. Soc. Trans. 39 (3), 789-797 (2011).
- Hofer, A. M., Landolfi, B., Debellis, L., Pozzan, T., Free Curci, S. Ca2+ dynamics measured in agonist-sensitive stores of single living intact cells: a new look at the refilling process. Embo J. 17 (7), 1986-1995 (1998).
- Hofer, A. M., Machen, T. E. Technique For InSitu Measurement of Calcium in Intracellular Inositol 1,4,5-Trisphosphate-Sensitive Stores Using The Fluorescent Indicator Mag-Fura-2. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90 (7), 2598-2602 (1993).
- Raju, B., Murphy, E., Levy, L. A., Hall, R. D., London, R. E. A fluorescent indicator for measuring cytosolic free magnesium. Am J Physiol. 256, (1989).
- Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu. Rev. Biochem. 67, 509-544 (1998).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Palmer, A. E., Jin, C., Reed, J. C., Tsien, R. Y. Bcl-2-mediated alterations in endoplasmic reticulum Ca2+ analyzed with an improved genetically encoded fluorescent sensor. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (50), 17404-17409 (2004).
- Heim, N., Griesbeck, O. Genetically Encoded Indicators of Cellular Calcium Dynamics Based on Troponin C and Green Fluorescent Protein. J. Biol. Chem. 279 (14), 14280-14286 (2004).
- Mank, M., et al. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. Biophys. J. 90 (5), 1790-1796 (2006).
- Garaschuk, O., Griesbeck, O., Konnerth, A. Troponin C-based biosensors: A new family of genetically encoded indicators for in vivo calcium imaging in the nervous system. Cell Calcium. 42 (4-5), 351-361 (2007).
- Carlson, H. J., Campbell, R. E. Mutational Analysis of a Red Fluorescent Protein-Based Calcium Ion Indicator. Sensors. 13 (9), 11507-11521 (2013).
- Wang, Q., Shui, B., Kotlikoff, M. I., Sondermann, H. Structural Basis for Calcium Sensing by GCaMP2. Structure. 16 (12), 1817-1827 (2008).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Tang, S., et al. Design and application of a class of sensors to monitor Ca2+ dynamics in high Ca2+ concentration cellular compartments. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108 (39), 16265-16270 (2011).
- Zou, J., et al. Developing sensors for real-time measurement of high Ca2+ concentrations. Biochemistry. 46 (43), 12275-12288 (2007).
- Wang, Z. -. M., Tang, S., Messi, M. L., Yang, J. J., Delbono, O. Residual sarcoplasmic reticulum Ca2+ concentration after Ca2+ release in skeletal myofibers from young adult and old mice. Pflugers Arch., EJP. 463 (4), 615-624 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Siemering, K. R., Golbik, R., Sever, R., Haseloff, J. Mutations that suppress the thermosensitivity of green fluorescent protein. Current Biology. 6 (12), 1653-1663 (1996).
- Reddish, F. N. . Design Of Genetically-Encoded Ca2+ Probes With Rapid Kinetics for Sub-Cellular Application [dissertation]. , (2016).
- Seo, M. D., Enomoto, M., Ishiyama, N., Stathopulos, P. B., Ikura, M. Structural insights into endoplasmic reticulum stored calcium regulation by inositol 1,4,5-trisphosphate and ryanodine receptors. Biochim. Biophys. Acta-Mol. Cell Res. 1853 (9), 1980-1991 (2015).
- Lambert, D. G. . Calcium signaling protocols. , (1999).
- Stephens, D. J., Allan, V. J. Light microscopy techniques for live cell imaging. Science. 300 (5616), 82-86 (2003).
- Bootman, M. D., Rietdorf, K., Collins, T., Walker, S., Sanderson, M. Ca2+-sensitive fluorescent dyes and intracellular Ca2+ imaging. Cold Spring Harb. 2013 (2), 83-99 (2013).
