लक्षित सीए के साथ ईआर / एसआर कैल्शियम रिलीज की निगरानी<sup> 2 +</sup> सेंसर कैचर<sup> +</sup
Summary
हम एचआईके 2 9 3 के एंडोप्लाज्मिक / सैर्कोप्लास्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर) और वास्तविक समय प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कंकाल की मांसपेशियों C2C12 कोशिकाओं में तेजी से कैल्शियम यात्रियों की निगरानी के लिए हमारे लक्षित आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सूचक (जीईसीआई) कैचर + के आवेदन के लिए प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। स्वस्थानी के डी माप और अंशांकन के लिए एक प्रोटोकॉल भी चर्चा की गई है।
Abstract
बाहरी उत्तेजनाओं द्वारा विकसित इंट्रासेल्युलर कैल्शियम (सीए 2 + ) ट्रांसइंटर्स जीवित जीवों में जैविक प्रक्रियाओं की एक बहुत कुछ शुरू करते हैं। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम रिलीज के केंद्र में प्रमुख इंट्रासेल्युलर कैल्शियम स्टोरेज ऑर्गेनेल, एन्डोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) और मांसपेशियों की कोशिकाओं में अधिक विशिष्ट सैर्कोप्लास्मिक रेटिकुलम (एसआर) हैं। इन ऑर्गेनेलों से कैल्शियम की गतिशील रिलीज़ रेनोोडीन रिसेप्टर (आरआईआर) और इनोसिटोल 1,4,5-त्रिफॉस्फेट रिसेप्टर (आईपी 3 आर) द्वारा सरको / एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम कैल्शियम एटपीस (एसईआरसीए) पंप के माध्यम से होने वाली फिर से भरने के साथ मध्यस्थ है। कैटरियल नामक एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड कैल्शियम सेंसर (जीईसीआई) को ईआर / एसआर से कैल्शियम की तीव्र रिहाई पर नजर रखने के लिए बनाया गया था। यहां, एचईके 2 9 3 और सी 2 सी -212 कोशिकाओं में सुधार, ईआर / एसआर-लक्षित जीईसीआई कैचर + के अभिकर्मक और अभिव्यक्ति के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल और आईपी 3 आर, राइआर, और एसईआरसीए की निगरानी में इसके आवेदन पंप-मध्यस्थता कैल्शियम क्षणिकHEK293 में प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग कोशिकाओं में रेखांकित किया गया है। रिसेप्टर एजिओनिस्ट या पसंद का अवरोधक चेंबर समाधान में छितरा हुआ है और वास्तविक समय में तीव्रता परिवर्तन दर्ज किए जाते हैं। इस पद्धति के साथ, ईआर कैल्शियम में कमी 4-क्लोरो-एम-क्रोसोल (4-सीसीसी), एडीनोसिन ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) के साथ आईपी 3 आर के अप्रत्यक्ष सक्रियण, और साइक्लोपियाज़ोनिक के साथ सेरका पंप के निषेध के साथ RyR सक्रियण के साथ देखा जाता है एसिड (सीपीए) हम सी 2 के 2 बी 12 कोशिकाओं में सीटू के डी और क्वांटिंग बेसल [सीए 2 + ] को निर्धारित करने के लिए प्रोटोकॉल पर भी चर्चा करते हैं। संक्षेप में, इन प्रोटोकॉल, कैचर + के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जाता है, ईआर / एसआर कैल्शियम से संबंधित रोगों के अध्ययन में भावी आवेदन के साथ ईएस से रिसेप्टर मध्यस्थता कैल्शियम रिलीज प्राप्त कर सकता है।
Introduction
इंटरासेल्युलर कैल्शियम (सीए 2 + ) ट्रांसएक्टर्स के स्पेसिओ-अस्थायी विशेषताओं में कई जैविक कार्यों को सक्रिय किया जाता है 1 इन सीए 2+ सिग्नलिंग इवेंट अलग सीम 2 + स्टोरेज ऑनेगल द्वारा अलग-अलग उत्तेजनाओं के माध्यम से और इंट्रासेल्युलर नियंत्रित करके कई सीए 2 + पंपों, चैनलों और सीए 2 + बाध्यकारी प्रोटीन के माध्यम से पेश किए जाते हैं। सीए 2+ ट्रांसिल्वेनस सिग्नल मॉड्यूलेशन के साथ दोषों के परिणामस्वरूप महत्वपूर्ण रूप से परिवर्तित किया जा सकता है, जो विभिन्न रोगों के लिए अग्रणी है। सीए 2+ सिग्नलिंग सिस्टम की गति और जटिलता के कारण, केंद्र में एन्डो- (एआर) और सर्पोप्लाज्मिक रेटिकुलम (एसआर) के साथ, आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड सीए 2+ जांच जो कि गतिशील अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया है, उन्हें तेजी से कैनेटीक्स के साथ अनुकूलित किया गया है विभिन्न कोशिकाओं में ग्लोबल और स्थानीय सीए 2 + परिवर्तनों को देखने के लिए
ईआर और एसआर, मांसपेशियों की कोशिकाओं में इसके समकक्ष, प्रमुख इंट्रासेल्युलर सीए 2+ स्टोरेज ऑर्गेनेल हैं और सीए 2 + सिंक के रूप में कार्य करते हैं जो सीए 2+ संकेत 4 को बढ़ाने में मदद करते हैं। ईआर / एसआर सीए 2+ में एक अभिन्न अंग है, जो एक ट्रांसमीटर और 5 सिग्नल के रिसीवर के रूप में दोहरी भूमिकाओं के साथ सिग्नल है। रायनोडाइन रिसेप्टर (आरआईआर) और इनॉसिटॉल 1,4,5-त्रिफॉस्फेट रिसेप्टर (आईपी 3 आर) सीए 2 + 6 द्वारा विनियमित ईआर / एसआर की झिल्ली पर स्थित सीए 2+ रिलीज रिसेप्टर्स हैं। अन्य एजेंट प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से इन रिसेप्टर्स के कार्य को उत्तेजित करते हैं। 4-क्लोरो-एम-क्रोसोल (4 सीसीसी) आरआरआर का एक शक्तिशाली एगोनिस्ट है, जिसमें एसआर सीए 2+ रिहाई के लिए कैफीन की तुलना में 10 गुना अधिक संवेदनशीलता होती है, जहां दोनों नियमित रूप से RyR- मध्यस्थता वाले सीए 2 ++ में पढ़ने के लिए नियोजित होते हैं स्वस्थ और रोगग्रस्त कोशिकाओं 7 एटीपी आईपी 3- वांछित सीए 2 + पुनः बढ़ाता हैआईपी 3 आर 8 के माध्यम से लीज एटीपी purinergic रिसेप्टर P2YR, एक जी प्रोटीन युग्मित रिसेप्टर (जीपीसीआर) से जुड़ा है, आईआर 3, जो ईआर 9 , 10 से सीए 2+ को रिलीज करने के लिए आईपी 3 आर के लिए बाइंड करता है, का उत्पादन ट्रिगर करता है। सर्को एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम कैल्शियम एटपेज (एसईआरसीए) पंप एक पी-प्रकार एटपेश पंप है, जो ईआर / एसआर झिल्ली पर भी स्थित है जो साइटोसोल सीए 2 + को कम करता है और एआर / एसआर द्वारा ईआर / एसआर लुमेन 11 एसईआरसीए पंप के विशिष्ट अवरोधकों में थापसियागर्नाका, थापसिगैरगिन और एस्परगिलस और पेनिसीलियम से साइक्लोपियाज़ोनिक एसिड (सीपीए) शामिल हैं । सीपीए को पंप के लिए कम आत्मीयता है और सीए 2 + एक्सेस प्वाइंट 12 को उल्टे तौर पर अवरुद्ध करता है थापसिगैरगिन, दूसरी तरफ, एम 3 हेलिक्स में नैनोमोल के साथ अवशेष F256 पर सीए 2 + फ्री पंप को अपरिवर्तनीय रूप से बांधता हैएआर एफ़िनिटी 11 सीए 2+ प्रेरित घटनाओं में शामिल परिवर्तनों का विश्लेषण और मात्रा बढ़ा है और एक चुनौती बनी हुई है। चूंकि ईआर / एसआर सीए 2 + सिग्नल के प्रसार में एक केंद्रीय समारोह के साथ डिब्बे वाला प्रमुख सबसेल्युलर सीए 2+ है , बहुत काम ईआर / एसआर सीए 2+ सिग्नलिंग 5 को समझने पर केंद्रित है।
सिंथेटिक Ca 2+ रंजियों के निर्माण ने सीए 2 + इमेजिंग के क्षेत्र और प्रथा को आगे बढ़ाने में मदद की। यद्यपि मैग-फुरा -2 जैसे रंगों का इस्तेमाल विभिन्न कोशिकाओं, 13 , 14 , 15 में compartmentalized Ca 2+ को मापने के लिए व्यापक रूप से किया गया है , जैसे कि असमान डाई लोडिंग, फोटोबलीचिंग और विशिष्ट ऑर्गनल्स को लक्षित करने की अक्षमता । हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) की खोज और फ्लोरोसेंट प्रोटीन की प्रगति -आधारित सीए 2+ जांच ने सीए 2 + इमेजिंग फॉरवर्ड 16 के फील्ड को आगे बढ़ाया है। कुछ मौजूदा जीईसीआई फोर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (एफआरईटी) जोड़े हैं जिनमें पीले फ्लोरोसेंट प्रोटीन (वाईएफपी), सियान फ्लोरोसेंट प्रोटीन (सीएफपी), कंडोडाडुलिन और एम 133 बाइंडिंग पेप्टाइड 17 , 18 शामिल हैं । ट्रॉपिनिन सी-आधारित जीईसीआई सीएफपी और सिट्रिन के एफईआरईटी जोड़े के रूप में उपलब्ध हैं और 1 9 , 20 , 21 के एकल फ्लोराफोरे जांच के रूप में उपलब्ध हैं। दूसरों, जैसे कि जीसीएएमपी 2 और आर-जीईको एकल फ्लोरोफोरे सेंसर हैं जिसमें शीतोडुलिन 22 , 23 शामिल हैं । क्यू डी के संकीर्ण ट्यूनिंग की सीमाओं को दूर करने के लिए और सीए 2 + बाइंडिंग डोमेन में मिली कई सीए 2 + बाइंडिंग साइट से जुड़ी सहकारी बंधन 24 , कैल्शियम सेन का एक उपन्यास वर्गसॉर्स को सीए 2 + बाइंडिंग साइट को बीटा बैरल की सतह पर बढ़ाया हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (ईजीएफपी) 25 , 26 के क्रोमोफोर संवेदनशील स्थान में डिजाइन करके बनाया गया था। कैचियर नामक यह बेहद चिंतित संवेदक के पास प्रसार सीमा के निकट 0.18 मिमी, ए के एक कश्मीर डी है और 700 एस -1 के एके बंद है सीलायर का उपयोग विभिन्न स्तनधारी सेल लाइनों जैसे हेला, एचईके 2 9 3, और सी 2 सी बी 2 25 में रिसेप्टर-मध्यस्थता ईआर / एसआर कैल्शियम रिलीज की निगरानी के लिए किया गया है। अपने तेज कैनेटीक्स की वजह से, कैचियर का प्रयोग युवा और पुराने मित्र वायरस बी एनआईएच जैक्सन (एफवीबी) चूहों के फ्लेक्स डेंटेरोरम ब्रेविस (एफडीबी) मांसपेशियों के तंतुओं में किया गया था, जो यह पता लगाने के लिए कि सीए 2 + 2 एफडीबी में वी 2 युवा चूहों की तुलना में पुराने चूहों के फाइबर 27 37 डिग्री सेल्सियस पर अपने कम प्रतिदीप्ति को दूर करने के लिए, जो स्तनधारी के कैल्शियम इमेजिंग में अपने अनुप्रयोगों को बाधित करता हैकोशिकाओं, हमने कैचर का एक बेहतर संस्करण कैचर नामक + विकसित किया है कैचर + स्तनधारी कोशिकाओं में बेहतर आवेदन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ाया प्रतिदीप्ति दर्शाता है। Catcher + बनाने के लिए थर्मोस्टाबिलिटी और प्रतिदीप्ति 37 डिग्री सेल्सियस 28 , 2 9 पर सुधार करने के लिए अतिरिक्त म्यूटेशन को कैचर में शामिल किया गया था। कैचर + कैचियर 30 पर शोर अनुपात (एसएनआर) के संकेत में छः गुना वृद्धि दिखाती है
यहाँ, संस्कृति और एचईके 2 9 3 और C2C12 कोशिकाओं के संचय के लिए प्रोटोकॉल और सीएआरएआर + और ईआर / एसआर रिसेप्टर-मध्यस्थता वाले कैल्शियम यात्रियों की निगरानी के लिए इसके आवेदन प्रस्तुत किए जाते हैं। प्रतिनिधि परिणाम 4-सीसीसी, सीपीए और एटीपी के साथ इलाज वाले HEK293 कोशिकाओं में व्यक्त कैचर + के लिए दिखाए गए हैं। हम C2C12 myoblast कोशिकाओं और योग्यता में Catcher + के सीटू के डी को निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल भी प्रदान करते हैंबेसल के एनटीफिकेशन [सीए 2 + ]
Protocol
Representative Results
Discussion
रिसीप्टर एगोनिस्ट या प्रतिपक्षियों के जवाब में प्रत्येक सेल में जटिल ईआर / एसआर सीए 2 + सिग्नलिंग प्रक्रियाओं का विश्लेषण करने के लिए कैसर + जैसे फ्लोरोसेंट जांचों के एकल एकल इमेजिंग लाइव एक प्?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनआईएच जीएम 629 99, एनआईएच ईबी 2007268, एनआईएएच एजी 15820, बीएंडबी बीज ग्रांट, और एनआईएच पूरक अनुदान को एफआर, बी बी फेलोशिप को सीएम, सीडीटी फेलोशिप आरजी को प्रदान किया गया था।
Materials
| 4-Chloro-3-methylphenol (4-CmC) | Sigma-Aldrich | C55402 |
| 515DCXR dichroic mirror | Chroma Technology Corp. | NC338059 |
| Adenosine 5′-triphosphate disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A26209 |
| Calcium chloride dihydrate | EMD Millipore | 102382 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (100 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430167 |
| Corning tissue-culture treated culture dishes (60 mm) | Sigma-Aldrich | CLS430166 |
| Cyclopiazonic Acid (CPA) | EMD Millipore | 239805 |
| D(+)-Glucose | ACROS Organics | 41095-0010 |
| Dow Corning 111 Valve Lubricant & Sealant | Warner Instruments | 64-0275 |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D7777 |
| Ethylenebis(oxyethylenenitrilo) tetraacetic Acid (EGTA) |
ACROS Organics | 409911000 |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | ThermoFisher | 26140087 |
| Fisherbrand Cover Glasses 22×40 mm | Fisher Scientific | 12-544B |
| Hanks’ Balanced Salts (HBSS) | Sigma-Aldrich | H4891 |
| HEPES, Free Acid, Molecular Biology Grade | EMD Millipore | 391340 |
| Immersion Oil without autofluorescence | Leica | 11513859 |
| Ionomycin, Free Acid | Fisher Scientific | 50-230-5804 |
| Leica DM6100B inverted microscope with a cooled EM-CCD camera | Hamamatsu | C9100-13 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | ThermoFisher | 11668019 |
| Lipofectamine 3000 Transfection Reagent | ThermoFisher | L3000015 |
| Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26GLP |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Fisher Scientific | M33-500 |
| Opti-MEM | ThermoFisher | 51985034 |
| Potassium Chloride | EMD Millipore | PX1405 |
| Potassium Phosphate, Dibasic | EMD Millipore | PX1570 |
| Potassium Phosphate, Monobasic | EMD Millipore | PX1565 |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 |
| SimplePCI Image Analysis Software | Hamamatsu | N/A |
| Sodium Bicarbonate | Fisher Scientific | S233-3 |
| Sodium Chloride | Fisher Scientific | S271-500 |
| Sterivex-GV 0.22 µm filter | EMD Millipore | SVGVB1010 |
| Till Polychrome V Xenon lamp | Till Photonics | N/A |
| Trypsin (2.5%), no phenol red (10X) | ThermoFisher | 15090046 |
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