الضوء بوساطة تعديل عكسها من الميتوجين تنشيط كيناز مسار البروتين خلال تمايز الخلايا و<em> القيطم</em> التنمية الجنينية
Summary
يصف هذا البروتوكول استراتيجية أوبتوجينيتيك لتعديل النشاط كيناز البروتين كيناز (مابك) النشاط خلال تمايز الخلايا والتنمية القيطم الجنينية. هذه الطريقة تسمح للتفعيل عكسها من مسار تشوير مابك في ثقافة الخلايا الثدييات وفي الكائنات الحية متعددة الخلايا، مثل أجنة القيطم ، مع قرار المكاني والزماني العالي.
Abstract
نشاط كيناز أمر بالغ الأهمية لعدد كبير من الوظائف الخلوية، بما في ذلك تكاثر الخلايا، والتمايز، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج. خلال التطور الجنيني المبكر، نشاط كيناز ديناميكي للغاية وانتشاره عبر الجنين. وتستخدم عادة النهج الدوائية والوراثية للتحقيق في أنشطة كيناز. لسوء الحظ، فإنه من الصعب تحقيق قرار المكاني والزماني متفوقة باستخدام هذه الاستراتيجيات. وعلاوة على ذلك، فإنه ليس من الممكن السيطرة على نشاط كيناز بطريقة عكسها في الخلايا الحية والكائنات متعددة الخلايا. ولا يزال مثل هذا القيد عقبة أمام تحقيق فهم كمي لنشاط كيناز خلال التنمية والتمايز. يقدم هذا العمل استراتيجية أوبتوجينيتيك التي تستفيد من نظام بيسيسترونيك تحتوي على بروتينات فوتواكتفاتابل أرابيدوبسيس ثاليانا كريبتوكروم 2 (CRY2) ومجال N- محطة من كريبتوكروم التفاعل الحلزوني الأساسي حلقة الحلزون (سيبن). ريفيرسيويتحقق تنشيط بلي من كيناز بروتين كيناز (مابك) مسار الإشارات من خلال نقل البروتين بوساطة الضوء في الخلايا الحية. ويمكن تطبيق هذا النهج على الثقافات خلية الثدييات وأجنة الفقاريات الحية. هذا النظام بيسيسترونيك يمكن تعميمها للسيطرة على نشاط كينازاس أخرى مع آليات تفعيل مماثلة ويمكن تطبيقها على أنظمة نموذجية أخرى.
Introduction
وتشارك عوامل النمو في مجموعة واسعة من وظائف الخلية، بما في ذلك الانتشار، والتمايز، والهجرة، وموت الخلايا المبرمج، وتلعب دورا محوريا في العديد من الأحداث البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني والشيخوخة وتنظيم الحالة النفسية 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . العديد من عوامل النمو إشارة من خلال معقدة شلالات الإشارات داخل الخلايا. وغالبا ما يتم تشغيل هذه الأحداث الإشارات من قبل فسفرة الفوسفوريين عكسها في الأزياء المنظمة بدقة 6 ، 7 . وبالتالي، فإن فهم نتائج الإشارات من كيناز البروتين، والتي هي المسؤولة عن فسفرة البروتين، هو في الأساس المهم.
عوامل النمو المختلفة تعمل من خلال شبكة الإشارات المشتركة بين الخلايا، على الرغم من أنها تحفز ديستالاستجابات الخلوية الداخلية 8 ، 9 . وسطاء داخل الخلايا المشتركة من كينازات مستقبلات تشمل راس، راف، خارج الخلية كيناز تنظيم إشارة (إرك)، كيناز البروتين المنشط الميثان (مابك) / إرك كيناز (ميك)، فوسفهوانوسيتيد 3-كيناز (PI3K)، أكت، والفوسفوليباز C غاما ( 11) . وتشير الأدلة المتراكمة إلى أن تنوع الإشارات وخصوصيتها يعتمدان على التنظيم المكاني والزمني لنشاط التشوير 12 . على سبيل المثال، في خلايا ورم القواتم (PC12)، وتحفيز عامل نمو البشرة (إغف)، مما يؤدي إلى تكاثر الخلايا، ينشط عابرا مسار إرك 9 . من ناحية أخرى، التحفيز مع عامل نمو الأعصاب (نغف)، الأمر الذي يؤدي إلى تمايز الخلايا، ينشط مسار إرك بطريقة مستدامة 9 ، 13 . في مثقف rفي الخلايا العصبية قرن آمون، إشارات عابرة من قبل عامل التغذية العصبية المشتقة من الدماغ (بدف) يعزز نمو نيوريت الابتدائي، في حين أن الإشارات المستمرة يؤدي إلى زيادة نيوريت المتفرعة 14 . خلال التطور الجنيني المبكر، النشاط إرك فوسفهوريلاتد هو ديناميكية مؤقتا وينتشر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين 6 . وأظهرت شاشة وراثية حديثة خلال وقت مبكر جينوبوس التطور الجنيني أن إرك و أكت يشير شلالات، واثنين من مسارات المصب عامل النمو الأولي، وعرض ملامح التنشيط مرحلة محددة 7 . وبالتالي، فإن فهم نتائج تشوير كيناز يدعو إلى الأدوات التي يمكن أن تحقق الملامح المكانية والزمانية للنشاط كيناز مع قرار كاف.
النهج التجريبية التقليدية للتحقيق في الطبيعة الديناميكية لتنبيه إشارة أثناء التنمية تفتقر إلى القرار المكاني والزماني المرغوب فيه. على سبيل المثال، النهج الدوائية تستخدم الكيماويات الصغيرةجزيئات أو بيولوجية لتحفيز أو قمع تنبيغ الإشارة في الخلايا والأنسجة. الطبيعة المنتشرة لهذه الجزيئات الصغيرة يجعل من الصعب تقييد عملها إلى منطقة معينة من الفائدة 15 . النهج الوراثية (على سبيل المثال، ترانزجينيسيس ، ونظام كري-لوكس، أو الطفرات) غالبا ما تؤدي إلى تفعيل لا رجعة فيه أو قمع التعبير الجيني الهدف أو نشاط البروتين 16 ، 17 ، 18 . يوفر نظام تيت أون / تيت-أوف 19 التحكم الزماني المحسن في النسخ الجيني ولكنه يفتقر إلى التحكم المكاني الصارم لأنه يعتمد على انتشار التتراسيكلين. التطورات الأخيرة في كيميائيا البروتين الناجم ديمريزاتيون 20 أو الصورة-التشبيك 21 ، 22 ، 23 ، 24 قد تعزز إلى حد كبيرإد التحكم الزمني لشبكات الإشارات. ومع ذلك، لا تزال السيطرة المكانية تشكل تحديا بسبب الطبيعة المنتشرة للمواد الكيميائية في قفص.
النهج الحديثة أوبتوجينيتيك الناشئة، التي تسخير قوة الضوء للسيطرة على البروتينات التفاعلات البروتين، تسمح لتشكيل مسارات الإشارات مع دقة المكانية الزمانية العالية وكذلك عكسها. بعد فترة وجيزة من نجاحها الأولي في السيطرة على إطلاق الخلايا العصبية 25 ، 26 ، 27 ، تم توسيع علم البصريات الضوئية للسيطرة على العمليات الخلوية الأخرى، مثل النسخ الجيني، والترجمة، وهجرة الخلايا، والتمايز، وموت الخلايا المبرمج 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 . إستراتيجية باستخدام pتم تطوير البروتين البروتين هوتواكتفاتابل أرابيدوبسيس ثاليانا كريبتوكروم 2 (CRY2) البروتين والنطاق N- محطة من كريبتوكروم التفاعل الحلزون الأساسي حلقة الحلزون (سيبن) مؤخرا للسيطرة على نشاط RF1 كيناز في خلايا الثدييات وأجنة القيطم 35 . CRY2 يربط سيبن على التحفيز الضوء الأزرق، و CRY2 / سيبن مجمع البروتين ينفصل تلقائيا في الظلام 34 . الضوء الأزرق يثير العامل المساعد CRY2، فلافين الأدينين ثنائي النوكليوتيد (فاد)، الأمر الذي يؤدي إلى تغيير التوافقية في CRY2 وملزم لاحق ل سيبن. يمكن أن تنتج النشطات التأسيسية (W374A) و فلافين ناقصة (D387A) المسوخ من CRY2 من خلال الطفرات في جيب ملزم فاد: و CRY2 W374A متحولة يربط سيبن مستقلة عن الضوء، في حين أن CRY2 D387A متحولة لا يرتبط سيبن تحت الأزرق التحفيز الضوء 36 ، 37 . نظام أوبتوجينيتيك وصفها طن هذا البروتوكول يستخدم البرية من نوع CRY2 و سيبن للحث على البروتين بوساطة بوساطة RF1 تفعيل في الخلايا الحية. ومن المعروف أن تجنيد الغشاء من راف 1 يعزز نشاطها 38 . في هذا النظام، وترتكز جنبا إلى جنب وحدة سيبن إلى غشاء البلازما و CRY2-مشيري تنصهر إلى N- محطة من RF1 35 . في غياب الضوء الأزرق، CRY2-مشيري-RF1 يبقى في السيتوبلازم، و RF1 غير نشط. تحفيز الضوء الأزرق يدفع CRY2-سيبن ملزمة وتجند RF1 إلى غشاء البلازما، حيث يتم تنشيط RF1. تنشيط راف يحفز سلسلة تشوير راف / ميك / إرك. يتم ترميز كل من البروتينات CRY2- و سيبن الانصهار في النظام الجيني بيسيترونيك. ويمكن تعميم هذه الاستراتيجية للسيطرة على كينازات أخرى، مثل أكت، التي يمكن تفعيلها الدولة تفعيلها أيضا عن طريق نقل البروتين في الخلايا 39 . يقدم هذا العمل بروتوكولات مفصلة لتنفيذ هذه الاستراتيجية أوبتوجينيتيك في كولتو الخلية الثديياتريس والكائنات متعددة الخلايا.
Protocol
Representative Results
Discussion
عند بناء مربع الضوء، ينبغي قياس قوة المصابيح الفردية. استنادا إلى الخبرة السابقة، يمكن أن تختلف انتاج الطاقة بين المصابيح الفردية بسبب التباين التصنيع. حدد مجموعة من المصابيح التي لديها انتاج الطاقة في غضون 10٪ من بعضها البعض. ويمكن تعديل عدد من المصابيح، المقاوم الح…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل جامعة إلينوي في أوربانا شامبين (إيوك) والمعاهد الوطنية للصحة (نيغمس R01GM111816).
Materials
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
- Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
- Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
- Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
- Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
- Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
- Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
- Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
- Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
- Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
- Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
- Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
- Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
- Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
- Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
- Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
- Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
- Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
- Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
- Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
- Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
- Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
- Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
- Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
- Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
- Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
