세포 분화 동안 미토 겐 활성 단백질 키나아제 경로의 광 매개 가역적 변조<em> Xenopus</em> 배아 발달
Summary
이 프로토콜은 세포 분화 및 Xenopus 배아 발달 동안 mitogen – 활성화 단백질 키니 아제 (MAPK) 활동을 조절하는 optogenetic 전략을 설명합니다. 이 방법은 포유류 세포 배양 및 높은 공간적 및 시간적 해상도를 갖는 Xenopus 태아와 같은 다세포 생균에서 MAPK 신호 전달 경로의 가역적 활성화를 허용한다.
Abstract
키나아제 활성은 세포 증식, 분화, 이동 및 세포 사멸을 비롯한 과다한 세포 기능에 결정적이다. 초기 배아 발달 동안, 키나아제 활성은 매우 동적이며 배아에 널리 퍼져있다. 약리학 적 및 유전 적 접근법은 일반적으로 키나제 활동을 조사하는데 사용됩니다. 불행하게도 이러한 전략을 사용하여 우수한 공간적 및 시간적 해결책을 얻는 것은 어렵습니다. 또한, 생세포 및 다세포 생물에서 가역적 인 방식으로 키나제 활성을 조절하는 것은 현실적이지 못하다. 이러한 제한은 발달 및 분화 과정에서 키나아제 활성의 정량적 이해를 달성하기위한 병목으로 남아있다. 이 연구는 광 활성화 단백질 인 Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (CRY2)와 cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN)의 N- 말단 도메인을 포함하는 바이 시스 트론 시스템을 이용하는 광 생성 전략을 제시한다. 리버시mitogen-activated protein kinase (MAPK) 신호 전달 경로의 활성화는 살아있는 세포에서 빛을 매개로하는 단백질 전좌를 통해 이루어진다. 이 접근법은 포유류 세포 배양 및 살아있는 척추 배아에 적용될 수 있습니다. 이 bicistronic 시스템은 유사한 활성화 메커니즘을 가진 다른 키나제의 활성을 조절하기 위해 일반화 될 수 있으며 다른 모델 시스템에도 적용될 수 있습니다.
Introduction
성장 인자는 증식, 분화, 이동 및 세포 사멸을 포함하여 다양한 세포 기능에 관여하며 배아 발달, 노화 및 정신 상태 조절을 비롯한 많은 생물학적 사건에서 중추적 인 역할을한다 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . 많은 성장 인자가 복잡한 세포 내 신호 전달 계통을 통해 신호를 보냅니다. 이러한 신호 전달 사건은 가끔 정교하게 조절 된 방식으로 가역성 단백질 인산화에 의해 작동된다. 따라서 단백질 인산화에 관여하는 단백질 키나아제의 신호 결과에 대한 이해는 근본적으로 중요합니다.
서로 다른 성장 인자가 dist를 자극하더라도 다소 일반적인 세포 내 신호 전달 네트워크를 통해 작용합니다.inct 세포 반응 8 , 9 . 수용체 티로신 키나아제의 일반적인 세포 내 매개체에는 Ras, Raf, 세포 외 신호 조절 키나아제 (MAPK) / ERK 키나제 (MEK), 포스 포이 노시 티드 3- 키나아제 (PI3K), Akt 및 포스 포 리파아제 Cγ (PLCγ) 10 , 11 . 축적 된 증거는 신호 다양성과 특이성이 신호 활동의 공간적, 시간적 조절에 달려 있음을 시사한다. 예를 들어, 쥐 갈색 세포종 세포 (PC12)에서 세포 증식을 일으키는 상피 세포 성장 인자 (EGF) 자극은 일시적으로 ERK 경로를 활성화시킵니다. 반면에, 세포 분화를 유도하는 신경 성장 인자 (NGF)로 자극하면 ERK 경로가 지속적으로 활성화됩니다 9 , 13 . 배양 된 r해마 뉴런에서 뇌 – 유도 신경영 인자 (BDNF)에 의한 일시적인 신호 전달은 1 차 신경 돌기의 성장을 촉진하는 반면, 지속적인 신호 전달은 증가 된 신경 돌기 분기를 유도한다. 초기 배아 발달 과정에서 인산화 ERK 활성은 일시적으로 역동적이며 배아 전반에 널리 퍼져있다. 초기의 Xenopus 배 발생 동안의 최근 유전자 스크린은 ERK 및 Akt 신호 전달 계류 (2 개의 다운 스트림 주 성장 인자 경로)가 단계 특이 적 활성화 프로파일을 나타내는 것으로 나타났다. 따라서, 키나아제 신호 결과의 이해는 충분한 분해능으로 키나아제 활성의 공간적 및 일시적 특징을 조사 할 수있는 도구를 필요로한다.
개발 과정에서 신호 변환의 동적 특성을 조사하기위한 기존의 실험적 접근 방법은 바람직한 공간적 및 시간적 해결책이 부족합니다. 예를 들어, 약리학 적 접근법은 작은 화학 물질세포 또는 조직에서의 신호 전달을 자극 또는 억제하기위한 생체 분자 또는 생물 분자. 이 작은 분자들의 확산 성질은 자신의 행동을 특정 관심 영역으로 제한하는 것을 어렵게 만든다. 유전자 접근법 ( 예 : 형질 전환, Cre-Lox 시스템 또는 돌연변이 유발)은 종종 표적 유전자 발현 또는 단백질 활성의 비가 역적 활성화 또는 억제를 유도합니다 16 , 17 , 18 . Tet-On / Tet-Off 시스템 19 는 유전자 전사의 향상된 시간 제어를 제공하지만 테트라 사이클린의 확산에 의존하기 때문에 엄격한 공간 제어가 부족합니다. 화학적으로 유도 된 단백질 이량 체화 (20) 또는 광 – 언 케이 징 ( uncaging ) 21 , 22 , 23 , 24의 최근 개발은 크게 향상되었다시그널링 네트워크의 시간 제어. 그러나 공간 제어는 갇힌 화학 물질의 확산 특성으로 인해 여전히 어려움을 겪고 있습니다.
단백질 – 단백질 상호 작용을 제어하기 위해 빛의 힘을 이용하는 최근 출현하는 광 생성 접근법은 높은 시공간 정밀도 및 가역성을 갖는 신호 전달 경로의 조절을 허용한다. 뉴런 사격 조절에있어 초기 성공 직후 25 , 26 , 27 , optogenetics는 유전자 전사, 번역, 세포 이동, 분화 및 세포 사멸과 같은 다른 세포 과정을 제어하기 위해 확장되었다 .28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 . p를 사용하는 전략(CRY2) 단백질과 Cryptochrome-interacting basic-helix-loop-helix (CIBN)의 N- 말단 도메인은 최근 포유류 세포와 Xenopus 배아에서 Raf1 키나아제 활성을 조절하기 위해 개발되었다. CRY2는 청색광 자극시 CIBN에 결합하고, CRY2 / CIBN 단백질 복합체는 암흑에서 자발적으로 해리한다. 청색광은 CRY2 보조 인자 인 플라 빈 아데닌 디 뉴클레오타이드 (FAD)를 자극하여 CRY2의 구조 변화와 그 후의 CIBN 결합을 유도합니다. CRY2의 구조적 활성 (W374A) 및 플라 빈 결핍 (D387A) 돌연변이는 FAD 결합 주머니의 돌연변이를 통해 생산 될 수 있습니다. CRY2 W374A 돌연변이는 빛과 무관하게 CIBN에 결합하지만 CRY2 D387A 돌연변이는 파란색으로 CIBN에 결합하지 않습니다 가벼운 자극 36 , 37 . optogenetic 시스템은 내가 설명한이 프로토콜은 야생형 CRY2와 CIBN을 사용하여 살아있는 세포에서 단백질 전좌 매개 Raf1 활성화를 유도합니다. Raf1의 멤브레인 모집은 그것의 활성을 증가시키는 것으로 알려져있다 38 . 이 시스템에서 탠덤 CIBN 모듈은 원형질막에 고정되어 있으며 CRY2-mCherry는 Raf1 35 의 N- 말단에 융합되어 있습니다. 푸른 빛이없는 경우, CRY2-mCherry-Raf1은 세포질에 머무르고, Raf1은 비활성입니다. 푸른 빛 자극은 CRY2-CIBN 결합을 유도하고 Raf1이 활성화 된 원형질막으로 Raf1을 모집합니다. Raf 활성화는 Raf / MEK / ERK 신호 전달 캐스케이드를 자극한다. CRY2 및 CIBN- 융합 단백질은 모두 바이 시스 트론 유전 시스템에서 코딩된다. 이 전략은 Akt와 같은 다른 키나아제를 조절하기 위해 일반화 될 수 있으며, 활성화 상태는 세포에서 단백질 전좌에 의해 활성화 될 수 있습니다 39 . 이 작품은 포유류 세포 cultu 에서이 optogenetic 전략을 구현하기위한 상세한 프로토콜을 제공합니다res 및 다세포 생물.
Protocol
Representative Results
Discussion
조명 상자를 만들 때 개별 LED의 전원을 측정해야합니다. 이전의 경험을 바탕으로 제조 출력 차이로 인해 LED마다 전원 출력이 다를 수 있습니다. 서로 10 % 이내의 출력을 갖는 LED 세트를 선택하십시오. LED의 수, 전류 제한 저항 및 전원 입력은 다양한 유형의 세포 배양 용기 ( 예 : 6- 웰 또는 24- 웰 플레이트)에 대해 수정할 수 있습니다. 0.2mW / cm 2 의 출력에서 24 시간 동안 빛을 비?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 Urbana-Champaign의 일리노이 대학 (UIUC)과 국립 보건원 (NIGMS R01GM111816)의 지원을 받았다.
Materials
| Glass coverslip | VWR | 48393 230 | Substrate for live cell imaging |
| Coverslip holder | Newcomer Supply | 6817B | Holder for coverslips |
| Detergent | ThermoFisher | 16 000 104 | For cleaning coverslips |
| Boric acid | Sigma-Aldrich | B6768-500G | For making PLL buffer |
| Disodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 71996-250G | For making PLL buffer |
| Plastic beaker | Nalgene | 1201-1000 | For cleaning coverslips |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 221465-2.5KG | For adjust pH |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1274-500MG | For coating coverslip |
| Diethylpyrocarbonate (DEPC)-Treated Water | ThermoFisher Scientific | 750024 | For DNA preparation |
| Cover Glass Forceps | Ted Pella | 5645 | Cover glass handling |
| Tissue cutlure dish | Thermofisher | 12565321 | Cell culture dish |
| Sterile centrifuge tubes | ThermoFisher | 12-565-271 | Buffer storage |
| Transfection Reagent | ThermoFisher | R0534 | Transfection |
| CO2-independent medium | ThermoFisher | 18045088 | For live cell imaging |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Form make cell chamber |
| Plasmid Maxiprep kit | Qiagen | 12965 | Plasmid preparation |
| DMEM medium | ThermoFisher | 11965-084 | Cell culturing medium component |
| F12K medium | ThermoFisher | 21127022 | Cell culturing medium component |
| Horse serum | ThermoFisher | 16050122 | Cell culturing medium component |
| Fetal Bovine Serum | Signa-Aldrich | 12303C-500 mL | Cell culturing medium component |
| Penicillin-Streptomycin-Glutamine | ThermoFisher | 10378016 | Cell culturing medium component |
| Trypsin (0.25%), phenol red | ThermoFisher Scientific | 15050065 | For mammalian cell dissociation |
| Agarose | Fisher Scientific | BP1356-100 | For DNA preparation |
| Ficoll PM400 | GE Heathcare Life Sciences | 17-5442-02 | For embryo buffer |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma-Aldrich | 1.02839.0025 | Oocyte preparation |
| ApaI | ThermoFisher | FD1414 | For linearization of plasmids |
| Dnase I | ThermoFisher | AM2222 | For removing DNA template in the in vitro transcription assay |
| Index-match materials (immersion oil) | Thorlabs | MOIL-20LN | For matching the index between sample substrate and objective |
| Blue LED | Adafruit | 301 | Light source for optogenetic stimulation |
| Resistor kit | Amazon | EPC-103 | current-limiting resistor |
| Aluminum boxes | BUD Industries | AC-401 | light box |
| BreadBoard | Jekewin | 837654333686 | For making LED array |
| Hook up Wire | Electronix Express | 27WK22SLD25 | For making LED array |
| Relay Module | Jbtek | SRD-05VDC-SL-C | For intermittent light control |
| DC Power Supply | TMS | DCPowerSupply-LW-(PS-305D) | Power supply for LED |
| Silicon Power Head | Thorlabs | S121C | For light intensity measurement |
| Power meter | Thorlabs | PM100D | For light intensity measurement |
| Microscope | Leica Biosystems | DMI8 | For live cell imaging |
| BioSafety Cabinet | ThermoFisher | 1300 Series A2 | For mammalian cell handling |
| CO2 incubator | ThermoFisher | Isotemp | For mammalian cell culturing |
| Stereo microscope | Leica | M60 | For embryo micro-manipulation |
| Microinjector | Narishige | IM300 | For embryo microinjection |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | P87 | Needle puller |
| in vitro transcription kit | ThermoFisher | AM1340 | For in vitro transcription. The kit includes nuclease-free water, SP6 RNA Polymerase, ribonucleotide mixture, cap analog, lithium choride precipitation solution, and spin column |
| RNA purfication kit | Qiagen | 74104 | Silica-membrane spin column for purification of synthesized RNA |
| Convection oven | MTI corporation | EQ-DHG-9015 | PDMS curing |
| Centrifugal mixer and teflon container | THINKY | AR310 | For mixing PDMS |
| Silicon wafer | UniversityWafer | 452 | Base for making PDMS devices |
| Blade | Techni Edge | 01-801 | For cutting PDMS |
| Capillary glass | Sutter Instruments | BF100-58-10 | For fabrication of injecting needles. |
References
- Schlessinger, J., Ullrich, A. Growth factor signaling by receptor tyrosine kinases. Neuron. 9 (3), 383-391 (1992).
- Thisse, B., Thisse, C. Functions and regulations of fibroblast growth factor signaling during embryonic development. Dev Biol. 287 (2), 390-402 (2005).
- Perrimon, N., Pitsouli, C., Shilo, B. Z. Signaling mechanisms controlling cell fate and embryonic patterning. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (8), a005975 (2012).
- Salles, F. H., et al. Mental disorders, functional impairment, and nerve growth factor. Psychol Res Behav Manag. 10, 9-15 (2017).
- Basson, M. A. Signaling in cell differentiation and morphogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. 4 (6), (2012).
- Schohl, A., Fagotto, F. beta-catenin, MAPK and Smad signaling during early Xenopus development. Development. 129 (1), 37-52 (2002).
- Zhang, S. W., Li, J. J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis. PloS one. 8 (11), e79469 (2013).
- Sweeney, C., et al. Growth factor-specific signaling pathway stimulation and gene expression mediated by ErbB receptors. J Biol Chem. 276 (25), 22685-22698 (2001).
- Marshall, C. J. Specificity of receptor tyrosine kinase signaling: transient versus sustained extracellular signal-regulated kinase activation. Cell. 80 (2), 179-185 (1995).
- Vandergeer, P., Hunter, T., Lindberg, R. A. Receptor Protein-Tyrosine Kinases and Their Signal-Transduction Pathways. Annu Rev Cell Biol. 10, 251-337 (1994).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Hunter, T. Signaling–2000 and beyond. Cell. 100 (1), 113-127 (2000).
- Qiu, M. S., Green, S. H. PC12 cell neuronal differentiation is associated with prolonged p21ras activity and consequent prolonged ERK activity. Neuron. 9 (4), 705-717 (1992).
- Ji, Y., et al. Acute and gradual increases in BDNF concentration elicit distinct signaling and functions in neurons. Nat Neurosci. 13 (3), 302-309 (2010).
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: volume, viscosity, diffusion, intracellular surface area. Int Rev Cytol. 192, 189-221 (2000).
- Sauer, B. Inducible gene targeting in mice using the Cre/lox system. Methods-a Companion to Methods in Enzymology. 14 (4), 381-392 (1998).
- Ling, M. M., Robinson, B. H. Approaches to DNA mutagenesis: an overview. Anal Biochem. 254 (2), 157-178 (1997).
- Gama Sosa, M. A., De Gasperi, R., Elder, G. A. Animal transgenesis: an overview. Brain Struct Funct. 214 (2-3), 91-109 (2010).
- Wanka, F., et al. Tet-on, or Tet-off, that is the question: Advanced conditional gene expression in Aspergillus. Fungal Genet Biol. 89, 72-83 (2016).
- Karginov, A. V., Ding, F., Kota, P., Dokholyan, N. V., Hahn, K. M. Engineered allosteric activation of kinases in living cells. Nat Biotechnol. 28 (7), 743-747 (2010).
- Liu, Q. Y., Deiters, A. Optochemical Control of Deoxyoligonucleotide Function via a Nucleobase-Caging Approach. Accounts of Chemical Research. 47 (1), 45-55 (2014).
- Arbely, E., Torres-Kolbus, J., Deiters, A., Chin, J. W. Photocontrol of tyrosine phosphorylation in mammalian cells via genetic encoding of photocaged tyrosine. J Am Chem Soc. 134 (29), 11912-11915 (2012).
- Gautier, A., Deiters, A., Chin, J. W. Light-activated kinases enable temporal dissection of signaling networks in living cells. J Am Chem Soc. 133 (7), 2124-2127 (2011).
- Nguyen, D. P., et al. Genetic Encoding of Photocaged Cysteine Allows Photoactivation of TEV Protease in Live Mammalian Cells. J Am Chem Soc. 136 (6), 2240-2243 (2014).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nat Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Banghart, M., Borges, K., Isacoff, E., Trauner, D., Kramer, R. H. Light-activated ion channels for remote control of neuronal firing. Nat Neurosci. 7 (12), 1381-1386 (2004).
- Zhang, K., Cui, B. Optogenetic control of intracellular signaling pathways. Trends in Biotechnology. 33 (2), 92-100 (2015).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (8), 551-558 (2014).
- Kim, B., Lin, M. Z. Optobiology: optical control of biological processes via protein engineering. Biochemical Society Transactions. 41 (5), 1183-1188 (2013).
- Tucker, C. L. Manipulating cellular processes using optical control of protein-protein interactions. Prog Brain Res. 196, 95-117 (2012).
- Toettcher, J. E., Gong, D. Q., Lim, W. A., Weiner, O. D. Light Control of Plasma Membrane Recruitment Using the Phy-Pif System. Method Enzymol. 497, 409-423 (2011).
- Zoltowski, B. D., Gardner, K. H. Tripping the light fantastic: blue-light photoreceptors as examples of environmentally modulated protein-protein interactions. Biochemistry. 50 (1), 4-16 (2011).
- Kennedy, M. J., et al. Rapid blue-light-mediated induction of protein interactions in living cells. Nat Methods. 7 (12), 973-975 (2010).
- Krishnamurthy, V. V., et al. Reversible optogenetic control of kinase activity during differentiation and embryonic development. Development. 143 (21), 4085-4094 (2016).
- Liu, H., et al. Photoexcited CRY2 Interacts with CIB1 to Regulate Transcription and Floral Initiation in Arabidopsis. Science. 322 (5907), 1535-1539 (2008).
- Li, X., et al. Arabidopsis cryptochrome 2 (CRY2) functions by the photoactivation mechanism distinct from the tryptophan (trp) triad-dependent photoreduction. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (51), 20844-20849 (2011).
- Leevers, S. J., Paterson, H. F., Marshall, C. J. Requirement for Ras in Raf Activation Is Overcome by Targeting Raf to the Plasma-Membrane. Nature. 369 (6479), 411-414 (1994).
- Kohn, A. D., Takeuchi, F., Roth, R. A. Akt, a pleckstrin homology domain containing kinase, is activated primarily by phosphorylation. J Biol Chem. 271 (36), 21920-21926 (1996).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Sive, H. L., Grainger, R. M., Harland, R. M. . Early Development of Xenopus laevis: A Laboratory Manual. , (2000).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PloS one. 6 (4), e18556 (2011).
- Ishimura, A., et al. Oncogenic Met receptor induces ectopic structures in Xenopus embryos. Oncogene. 25 (31), 4286-4299 (2006).
- Zhang, K., et al. Light-Mediated Kinetic Control Reveals the Temporal Effect of the Raf/MEK/ERK Pathway in PC12 Cell Neurite Outgrowth. PloS one. 9 (3), e92917 (2014).
- Mohanty, S. K., Lakshminarayananan, V. Optical Techniques in Optogenetics. J Mod Opt. 62 (12), 949-970 (2015).
- Taslimi, A., et al. Optimized second-generation CRY2-CIB dimerizers and photoactivatable Cre recombinase. Nature chemical biology. 12 (6), 425-430 (2016).
- Kawano, F., Suzuki, H., Furuya, A., Sato, M. Engineered pairs of distinct photoswitches for optogenetic control of cellular proteins. Nat Commun. 6, 6256 (2015).
- Wang, H., et al. LOVTRAP: an optogenetic system for photoinduced protein dissociation. Nat Methods. 13 (9), 755-758 (2016).
- Chang, K. Y., et al. Light-inducible receptor tyrosine kinases that regulate neurotrophin signalling. Nat Commun. 5, 4057 (2014).
- Boulina, M., Samarajeewa, H., Baker, J. D., Kim, M. D., Chiba, A. Live imaging of multicolor-labeled cells in Drosophila. Development. 140 (7), 1605-1613 (2013).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PLoS One. 7 (11), e50738 (2012).
- Buckley, C. E., et al. Reversible Optogenetic Control of Subcellular Protein Localization in a Live Vertebrate Embryo. Dev Cell. 36 (1), 117-126 (2016).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature chemical biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Beyer, H. M., et al. Red Light-Regulated Reversible Nuclear Localization of Proteins in Mammalian Cells and Zebrafish. ACS Synth Biol. 4 (9), 951-958 (2015).
