In Vitro Polimerización de la F-actina en endosomas tempranos
Summary
Primeras funciones de endosome dependen de polimerización de la actina F. Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de Bioquímica y genética manipulaciones.
Abstract
Muchas funciones endosome temprano, especialmente carga proteínas clasificación y membrana deformación, dependen de los parches de cortos filamentos F-actina nucleadas en la membrana endosomal. Hemos establecido un ensayo basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo, por lo que esta serie compleja de reacciones susceptibles de genética y bioquímica manipulaciones. Endosomal fracciones se preparan por flotación en gradientes de sacarosa de las células que expresan la proteína endosomal temprana RAB5 GFP. Fracciones citosólicas se preparan en cantidades separadas de las células. Endosomal y fracciones citosólicas pueden almacenarse congeladas en nitrógeno líquido, si es necesario. En el ensayo, las fracciones citosólicas y endosomal se mezclan, y la mezcla se incuba a 37 ° C en condiciones adecuadas (p. ej., fuerza iónica, reducir el medio ambiente). En el momento deseado, la mezcla de reacción se fija, y la F-actina se revela con phalloidin. Polimerización y la nucleación de la actinia se analizan por microscopía de fluorescencia. Aquí, Divulgamos que este ensayo puede utilizarse para investigar el papel de los factores que intervienen en la nucleación de la actina en la membrana, o en la posterior elongación, ramificación o entrecruzamiento de filamentos de actina F.
Introduction
En células eucariotas superiores, las proteínas y los lípidos se internalizan en endosomas tempranos donde se produce la separación. Algunas proteínas y lípidos, que están destinados a ser reutilizados, se incorporado en las regiones tubulares de los endosomas tempranos y entonces transportados a la membrana plasmática o a la trans-Golgi network (TGN)1,2. Por el contrario, otras proteínas y lípidos se empaquetan selectivamente en regiones de los endosomas tempranos que presentan un aspecto multivesicular. Amplían estas regiones y, sobre la separación de membranas endosomal temprana, finalmente madura en endosomal libre portador vesículas o cuerpos multivesicular (VCE/MVBs), que son responsables de transporte de carga hacia finales de endosomas1, 2.
Actinia desempeña un papel crucial en el proceso de remodelación de la membrana asociado a capacidad clasificación endosomal y biogénesis del endosome. Clasificación a lo largo de las vías de reciclado a la membrana plasmática o al TGN de la proteína depende el retrómero complejo y las proteínas asociadas. Esta maquinaria de clasificación parece estar acoplado a la formación de las reciclaje túbulos a través de interacciones del retrómero complejo, con la avispa y cicatriz homólogo (colada) actina complejo y ramificado3,4,5 . Por el contrario, destinado para la degradación de moléculas, particularmente activación receptores de señalización, se clasifican en vesículas intraluminales (ILVs) por endosomal clasificación complejos necesarios para transporte (TRASVESTIS)2,6, 7. Aunque no se conoce el posible papel de la actina en el proceso de clasificación de TRASVESTIS-dependiente, F-actina desempeña un papel importante en la biogénesis de la versión cefálica externa/MVBs y en el transporte más allá de endosomas tempranos. En particular, hemos encontrado que anexina A2 une regiones enriquecidas con colesterol de principios endosome y junto con spire1, nuclea la polimerización de la actina F. La formación de la red de actina ramificada en endosomas requiere la actividad de ramificación de la proteína relacionada con la actina (ARP) 2/3 complejo, así como el ERM proteína moesina y la Unión de la actina proteína cortactina8,9.
Aquí, describimos un análisis basado en la microscopía en vitro que reconstituye la nucleación y polimerización de la actina F en membranas de endosomal temprana en tubos de ensayo. Este análisis se ha utilizado previamente para investigar el papel de la anexina A2 en nucleación de F-actina y moesina y cortactina en la formación de endosomal actina redes8,9. Con este protocolo en vitro , la compleja serie de reacciones que se producen en endosomas durante la polimerización de la actina se convierten en susceptible al análisis bioquímico y molecular de los pasos secuenciales del proceso, incluyendo la nucleación de la actinia, lineal polimerización, ramificación y reticulación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actinia desempeña un papel crucial en el endosome membrana dinámica4,14. Hemos divulgado previamente que la polimerización y la nucleación de actina ocurren en endosomas tempranos, formando pequeños parches de F-actina o redes. Estas redes de F-actina son absolutamente necesarias para el transporte de membrana más allá de endosomas tempranos a lo largo de la vía de degradación. Interferir en cualquier paso de este proceso de nucleación y polimerización…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Se recibió apoyo de la Fundación Nacional Suiza de ciencia; el programa Sinergia suizo; el polaco-suizo de investigación programa (PSPB-094-2010); el NCCR en Biología química; y LipidX de la iniciativa de SystemsX.ch suizo, evaluados por la Swiss National Science Foundation (a J. G.). O. M. fue apoyado por una beca a largo plazo de la EMBO (ALTF-516-2012).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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