In Vitro Polimerização de F-Actina no início endossomos
Summary
Funções de endossomo precoce dependem de polimerização de F-Actina. Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de bioquímicos e genéticos manipulações.
Abstract
Muitas funções endossomo precoce, particularmente carga proteína classificação e membrana deformação, dependem de patches de curto F-Actina filamentos nucleated na membrana da CDDP. Nós estabelecemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio, tornando assim esta complexa série de reações passíveis de genética e bioquímica manipulações. CDDP frações são preparadas pela flutuação em gradientes de sacarose de celulas que expressam a início CDDP proteína GFP-RAB5. Citosólica frações são preparadas a partir de lotes separados das células. Tanto CDDP e citosólica frações podem ser armazenadas congelados em nitrogênio líquido, se necessário. No ensaio, o CDDP e frações citosólica são misturadas, e a mistura é incubada a 37 ° C, sob condições adequadas (por exemplo, força iônica, reduzindo o ambiente). No momento desejado, a mistura de reação é fixo, e a F-Actina é revelado com faloidina. Polimerização e nucleação de actina são então analisados por microscopia de fluorescência. Aqui, nós relatamos que este ensaio pode ser usado para investigar o papel dos fatores que estão envolvidos na nucleação de actina na membrana, ou no subsequente alongamento, ramificação ou reticulação de filamentos de actina-F.
Introduction
Em células eucarióticas superiores, proteínas e lipídios são internalizados em endossomos iniciais onde ocorre a classificação. Algumas proteínas e lipídios, que são destinados a ser reaproveitado, são incorporados em regiões tubulares dos endossomos iniciais e então transportados para a membrana plasmática ou para o trans-Golgi network (TGN)1,2. Em contraste, outras proteínas e lipídios são seletivamente empacotados em regiões dos endossomos iniciais que exibem uma aparência multivesiculares. Estas regiões expandir e, após descolamento de membranas de CDDP cedo, eventualmente maduro em vesículas de transportadora CDDP livre ou corpos multivesiculares (ECV/MVBs), que são responsáveis para o transporte de carga para tarde endossomos1, 2.
Actina desempenha um papel crucial no processo de remodelação de membrana associado com capacidade de classificação CDDP e biogênese endossomo. Proteína ao longo dos caminhos de reciclagem para a membrana plasmática ou para o TGN depende o retromer complexo e as proteínas associadas. Esta classificação máquinas parecem ser atrelado à formação de reciclagem túbulos através de interações do complexo, o retromer com a vespa e cicatriz homólogo (lavagem) ramificado e complexo actina3,4,5 . Em contraste, as moléculas destinados a degradação, particularmente ativado receptores de sinalização, são classificadas em vesículas intraluminal (ILVs) pelo CDDP classificação complexos necessários para transporte (ESCRT)2,6, 7. Enquanto o possível papel de actina no processo de classificação de ESCRT-dependente não é conhecido, F-Actina desempenha um papel importante na biogênese de ECV/MVBs e no transporte, além de endossomos iniciais. Em particular, encontramos que anexina A2 vincula colesterol enriquecido regiões do endossomo precoce e juntamente com spire1, nucleates polimerização F-Actina. A formação da rede ramificada actina observada no endossomos requer a atividade de ramificação da proteína actina-relacionados (ARP) 2/3 complexo, bem como a moesin de proteína ERM e o emperramento do actínio proteína ciclina8,9.
Aqui, descrevemos um ensaio baseado em microscopia em vitro que reconstitui a nucleação e polimerização de F-Actina nas membranas de CDDP precoce em tubos de ensaio. Este ensaio tem sido usado anteriormente para investigar o papel da anexina A2 na nucleação de F-Actina e da moesin e ciclina na formação da CDDP actina redes8,9. Com este protocolo em vitro , a complexa série de reações que ocorrem na endossomos durante a polimerização de actina tornam-se receptivos à análise bioquímica e molecular das etapas sequenciais do processo, incluindo a nucleação de actina, linear polimerização, ramificação e reticulação.
Protocol
Representative Results
Discussion
Actina desempenha um papel crucial na endossomo membrana dinâmica4,14. Informamos anteriormente que a polimerização e a nucleação de actina ocorrem em endossomos iniciais, formando pequenas manchas de F-Actina ou redes. Estas redes de F-Actina são absolutamente necessários para o transporte de membrana além endossomos iniciais ao longo da via de degradação. Interferir em qualquer etapa deste processo de nucleação e polimerização impede endossomo mat…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoio recebido dos Swiss National Science Foundation; o programa Sinergia suíço; os polonês-Swiss investigação programa (PSPB-094/2010); o NCCR em biologia química; e LipidX da iniciativa Suíça SystemsX.ch, avaliada pela Swiss National Science Foundation (a G.). O. M. foi apoiado por uma comunhão de longo prazo EMBO (ALTF-516-2012).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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