في المختبر بلمرة الأكتين و في وقت مبكر اندوسوميس
Summary
مهام دخلول المبكر تعتمد على بلمرة الأكتين و. هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة للكيمياء الحيوية والوراثية التلاعب.
Abstract
العديد من الدالات دخلول المبكر، لا سيما البضائع البروتين الفرز والغشاء تشوه، تعتمد على بقع من خيوط الأكتين و القصيرة المنبسطة على الغشاء اندوسومال. وقد أنشأنا المستندة إلى الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة الوراثية والبيوكيميائية التلاعب. الكسور اندوسومال يعدها التعويم في التدرجات السكروز من الخلايا معربا عن البروتين اندوسومال المبكر RAB5 التجارة والنقل. وتعد كسور سيتوسوليك من مجموعات منفصلة من الخلايا. اندوسومال والكسور سيتوسوليك يمكن تخزينها مجمدة في النتروجين السائل، إذا لزم الأمر. في التحليل، تختلط اندوسومال والكسور سيتوسوليك، وهي المحتضنة المخلوط في 37 درجة مئوية تحت الظروف الملائمة (مثلاً، الأيونية القوام، الحد من البيئة). في الوقت المطلوب، الخليط رد الفعل هو ثابت، وهو كشف والاكتين مع فالويدين. ثم يتم تحليل التنو أكتين والبلمره بالفحص المجهري الأسفار. هنا، نحن التقرير أنه يمكن استخدام هذا الفحص للتحقيق في دور العوامل التي تشارك أما في نويات أكتين على الغشاء، أو في استطالة اللاحقة، التفريع، أو كروسلينكينج من خيوط الأكتين و.
Introduction
في الخلايا حقيقية النواة أعلى، يتم استيعاب البروتينات والدهون في اندوسوميس المبكرة التي يحدث فيها الفرز. بعض البروتينات والدهون، التي تتجه إلى أن تكون تستخدم، يتم دمج المناطق أنبوبي من اندوسوميس المبكر وثم تنقل إلى غشاء البلازما أو غولجي عبر الشبكة (TGN)1،2. على النقيض من ذلك، البروتينات والدهون الأخرى يتم تعبئتها بشكل انتقائي في مناطق اندوسوميس المبكر الذي يحمل مظهر مولتيفيسيكولار. توسيع هذه المناطق، ولدى مفرزة من أوائل اندوسومال الأغشية، ناضجة في نهاية المطاف إلى حويصلات الناقل اندوسومال الحرة أو الهيئات مولتيفيسيكولار (التحويل الرأسي الخارجي/مفبس)، التي هي المسؤولة عن نقل البضائع نحو أواخر اندوسوميس1، 2.
أكتين يلعب دوراً حاسما في عملية يعيد غشاء المرتبطة بقدرة الفرز اندوسومال ونشوء حيوي دخلول. الفرز على طول مسارات إعادة التدوير لغشاء البلازما أو TGN البروتين يعتمد على ريترومير المعقدة والبروتينات المرتبطة بها. هذه الآلية الفرز ويبدو أن تكون مقترنة بتشكيل الأنابيب إعادة التدوير عن طريق تفاعلات ريترومير المعقدة، مع دبور وندبة المناظرة (غسل) أكتين المعقدة وتشعبت3،4،5 . على النقيض من ذلك، جزيئات متجهة إلى التدهور، لا سيما تنشيط مستقبلات الإشارات، يتم فرز في الحويصلات intraluminal (إيلفس) من اندوسومال الفرز مجمعات المطلوبة للنقل (اسكرت)2،6، 7. واو-أكتين بينما لا يعرف الدور المحتمل أكتين في عملية الفرز المعتمدة على اسكرت، يلعب دوراً مهما في نشوء حيوي للتحويل الرأسي الخارجي/مفبس والنقل خارج اندوسوميس المبكر. على وجه الخصوص، وجدنا أن أنيكسين A2 يربط المناطق الغنية بالكوليسترول دخلول المبكر، وجنبا إلى جنب مع spire1، نوكليتيس بلمرة الأكتين و. ويتطلب تشكيل شبكة أكتين تشعبت يحتفل في اندوسوميس النشاط المتفرعة من البروتين المتصلة أكتين (ARP) 2/3 معقدة، فضلا عن موسين البروتين ERM والبروتين ملزمة أكتين كورتاكتين8،9.
هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار. وقد استخدمت هذه المقايسة سابقا للتحقيق في دور أنيكسين A2 في نويات واكتين وموسين وكورتاكتين في تشكيل اندوسومال أكتين شبكات8،9. بهذا البروتوكول في المختبر ، سلسلة معقدة من التفاعلات التي تحدث في اندوسوميس أثناء بلمرة الأكتين تصبح قابلة لتحليل الكيمياء الحيوية والجزيئية لخطوات متسلسلة من هذه العملية، بما في ذلك التنو أكتين، الخطي بلمرة والمتفرعة، وكروسلينكينج.
Protocol
Representative Results
Discussion
أكتين يلعب دوراً حاسما في دخلول غشاء ديناميات4،14. نحن أفاد سابقا أن التنو أكتين والبلمره تحدث في وقت مبكر اندوسوميس، تشكيل بقع واكتين أو الشبكات الصغيرة. وتشكل هذه الشبكات واكتين المطلوبة على الإطلاق للنقل الغشاء خارج اندوسوميس المبكر على طول مسار التدهور….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وتلقى دعما من “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية”؛ البرنامج “سينيرجيا السويسرية”؛ البولندية-السويسرية البحث البرنامج (بسبب-094/2010)؛ نككر في مجال البيولوجيا الكيميائية؛ وليبيد من المبادرة السويسرية SystemsX.ch، التي تقيمها “مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية” (إلى ج. غ.). وأيد م. سين التطريز زمالة طويلة الأجل (التف-516-2012).
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
- Huotari, J., Helenius, A. Endosome maturation. EMBO J. 30 (17), 3481-3500 (2011).
- Scott, C. C., Vacca, F., Gruenberg, J. Endosome Maturation, Transport and Functions. Semin. Cell Dev Biol. 31, 2-10 (2014).
- Puthenveedu, M. A., et al. Sequence-dependent sorting of recycling proteins by actin-stabilized endosomal microdomains. Cell. 143 (5), 761-773 (2010).
- Seaman, M. N., Gautreau, A., Billadeau, D. D. Retromer-mediated endosomal protein sorting: all WASHed up!. Trends Cell Biol. 23 (11), 522-528 (2013).
- Burd, C., Cullen, P. J. Retromer: a master conductor of endosome sorting. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (2), a016774 (2014).
- Woodman, P. G., Futter, C. E. Multivesicular bodies: co-ordinated progression to maturity. Curr Opin Cell Biol. 20 (4), 408-414 (2008).
- Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. The ESCRT pathway. Dev Cell. 21 (1), 77-91 (2011).
- Morel, E., Gruenberg, J. Annexin A2 binding to endosomes and functions in endosomal transport are regulated by tyrosine 23 phosphorylation. J Biol Chem. 284 (3), 1604-1611 (2009).
- Muriel, O., Tomas, A., Scott, C. C., Gruenberg, J. Moesin and cortactin control actin-dependent multivesicular endosome biogenesis. Mol Biol Cell. 27 (21), 3305-3316 (2016).
- Sonnichsen, B., De Renzis, S., Nielsen, E., Rietdorf, J., Zerial, M. Distinct membrane domains on endosomes in the recycling pathway visualized by multicolor imaging of Rab4, Rab5, and Rab11. J Cell Biol. 149 (4), 901-914 (2000).
- Morel, E., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin A2-dependent polymerization of actin mediates endosome biogenesis. Dev Cell. 16 (3), 445-457 (2009).
- Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27 (8), 1179-1180 (2011).
- Meijering, E., et al. Design and validation of a tool for neurite tracing and analysis in fluorescence microscopy images. Cytometry A. 58 (2), 167-176 (2004).
- Granger, E., McNee, G., Allan, V., Woodman, P. The role of the cytoskeleton and molecular motors in endosomal dynamics. Semin Cell Dev Biol. 31, 20-29 (2014).
- Mayran, N., Parton, R. G., Gruenberg, J. Annexin II regulates multivesicular endosome biogenesis in the degradation pathway of animal cells. EMBO J. 22 (13), 3242-3253 (2003).
- Gorvel, J. P., Chavrier, P., Zerial, M., Gruenberg, J. rab5 controls early endosome fusion in vitro. Cell. 64 (5), 915-925 (1991).
- Wandinger-Ness, A., Zerial, M. Rab proteins and the compartmentalization of the endosomal system. Cold Spring Harb Perspect Biol. 6 (11), a022616 (2014).
- Balch, W. E., Glick, B. S., Rothman, J. E. Sequential intermediates in the pathway of intercompartmental transport in a cell-free system. Cell. 39 (3 Pt 2), 525-536 (1984).
