इन विट्रो बहुलकीकरण के F प-actin पर जल्दी Endosomes
Summary
अर्ली endosome फ़ंक्शंस F-actin बहुलकीकरण पर निर्भर करते हैं. यहां, हम वर्णन एक माइक्रोस्कोपी इन विट्रो परख है कि nucleation और बहुलकीकरण के परीक्षण ट्यूबों में जल्दी endosomal झिल्ली पर actin का पुनर्गठन, इस प्रकार की प्रतिक्रियाओं के इस जटिल श्रृंखला का प्रतिपादन जैव रासायनिक और आनुवंशिक के लिए उत्तरदायी जोड़तोड़.
Abstract
कई जल्दी endosome कार्यों, विशेष रूप से कार्गो प्रोटीन छंटाई और झिल्ली विकृति, endosomal झिल्ली पर nucleated लघु F-actin तंतुओं के धब्बे पर निर्भर करते हैं । हम एक माइक्रोस्कोपी की स्थापना की है-इन विट्रो परख है कि nucleation और बहुलकीकरण के परीक्षण ट्यूबों में जल्दी endosomal झिल्ली पर actin, इस प्रकार आनुवंशिक और जैव रासायनिक के लिए उत्तरदायी प्रतिक्रियाओं के इस जटिल श्रृंखला प्रतिपादन का पुनर्गठन जोड़तोड़. जल्दी Endosomal प्रोटीन GFP-RAB5 व्यक्त कोशिकाओं से सुक्रोज ढाल में फ्लोटेशन द्वारा Endosomal अंश तैयार कर रहे हैं । Cytosolic अंशों को कक्षों के पृथक बैच से तैयार किया जाता है. दोनों endosomal और cytosolic अंश तरल नाइट्रोजन में जमे हुए संग्रहीत किया जा सकता है, अगर जरूरत है । परख में, endosomal और cytosolic भागों मिश्रित कर रहे हैं, और मिश्रण ३७ डिग्री सेल्सियस पर उपयुक्त परिस्थितियों में मशीन है (जैसे, ईओण ताकत, पर्यावरण को कम करने) । वांछित समय पर, प्रतिक्रिया मिश्रण तय हो गया है, और एफ actin phalloidin के साथ पता चला है । Actin nucleation और बहुलकीकरण तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं । यहां, हम रिपोर्ट है कि इस परख कारकों है कि या तो झिल्ली पर actin nucleation में शामिल है की भूमिका की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या बाद में बढ़ाव, शाखाओं में, या एफ actin रेशा के crosslinking ।
Introduction
उच्च युकेरियोटिक कोशिकाओं में, प्रोटीन और लिपिड जल्दी endosomes में आंतरिक है जहां छंटाई होती है । कुछ प्रोटीन और लिपिड, जो भाग्य का उपयोग किया जा करने के लिए कर रहे हैं, जल्दी endosomes के ट्यूबलर क्षेत्रों में शामिल कर रहे है और फिर प्लाज्मा झिल्ली या ट्रांस Golgi नेटवर्क (TGN)1,2तक पहुंचाया । इसके विपरीत, अंय प्रोटीन और लिपिड चुनिंदा जल्दी endosomes है कि एक multivesicular उपस्थिति प्रदर्शन के क्षेत्रों में पैक कर रहे हैं । इन क्षेत्रों का विस्तार और, जल्दी endosomal झिल्ली से टुकड़ी पर, अंततः मुक्त endosomal वाहक बुलबुले या multivesicular निकायों में परिपक्व (ECV/MVBs), जो देर से endosomes1की दिशा में कार्गो परिवहन के लिए जिंमेदार हैं, 2.
Actin endosomal छंटाई क्षमता और endosome उत्पत्ति के साथ जुड़े झिल्ली remodeling प्रक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । प्लाज्मा झिल्ली या TGN के लिए रीसाइक्लिंग रास्ते के साथ छंटाई प्रोटीन retromer परिसर और जुड़े प्रोटीन पर निर्भर करता है । इस छंटाई मशीनरी retromer परिसर की बातचीत के माध्यम से रीसाइक्लिंग नलिकाओं के गठन के लिए युग्मित किया जा लगता है, ततैया और निशान homologue (धो) परिसर और शाखाओं में actin3,4,5 . इसके विपरीत, क्षरण के लिए किस्मत में अणुओं, विशेष रूप से संकेत रिसेप्टर्स सक्रिय, intraluminal बुलबुले में हल कर रहे हैं (ILVs) endosomal छँटाई परिवहन के लिए आवश्यक परिसरों (ESCRT)2,6, 7. जबकि ESCRT-निर्भर छंटाई प्रक्रिया में actin की संभव भूमिका ज्ञात नहीं है, F-actin ECV/MVBs की उत्पत्ति में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और जल्दी endosomes से परे परिवहन में । विशेष रूप से, हमने पाया कि annexin A2 जल्दी endosome के कोलेस्ट्रॉल समृद्ध क्षेत्रों को बांधता है, और spire1, nucleates F-actin बहुलकीकरण के साथ मिलकर । endosomes पर मनाया शाखाई actin नेटवर्क के गठन actin से संबंधित प्रोटीन (ARP) 2/3 जटिल की शाखाकरण गतिविधि की आवश्यकता है, साथ ही साथ एर्म प्रोटीन moesin और actin-बाध्यकारी प्रोटीन cortactin8,9।
यहां, हम वर्णन एक माइक्रोस्कोपी इन विट्रो परख कि nucleation और बहुलकीकरण के परीक्षण ट्यूबों में जल्दी endosomal झिल्ली पर एफ actin का पुनर्गठन आधारित है । इस परख पहले इस्तेमाल किया गया है F-actin nucleation में annexin A2 की भूमिका की जांच और moesin और cortactin के endosomal actin नेटवर्क8,9के गठन में । इसके साथ इन विट्रो प्रोटोकॉल, प्रतिक्रियाओं कि actin बहुलकीकरण के दौरान endosomes पर होने की जटिल श्रृंखला जैव रासायनिक और आणविक विश्लेषण करने के लिए उत्तरदायी बन प्रक्रिया के क्रमिक चरणों की, actin nucleation सहित, रैखिक बहुलकीकरण, बंटी, और crosslinking ।
Protocol
1. समाधान और तैयारी
नोट: सभी बफ़र्स और समाधान डबल-आसुत (dd) में तैयार किया जाना चाहिए H 2 O. क्योंकि सुक्रोज के जलयोजन राज्य बदलता है, सभी सुक्रोज समाधान के अंतिम एकाग्रता एक refractometer का उपयोग कर…
Representative Results
Discussion
Actin endosome झिल्ली गतिशीलता4,14में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । हम पहले की सूचना है कि actin nucleation और बहुलकीकरण जल्दी endosomes पर होते हैं, छोटे F-actin पैच या नेटवर्क बनाने । इन एफ actin नेटवर्क बिल्कु?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
समर्थन स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन से प्राप्त किया गया था; स्विस Sinergia कार्यक्रम; पोलिश-स्विस अनुसंधान कार्यक्रम (पीएसपीबी-094/ रासायनिक जीवविज्ञान में NCCR; और स्विस SystemsX.ch पहल से LipidX, स्विस राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा मूल्यांकन (जे. जी.) । ओ. एम. एक EMBO दीर्घकालिक फैलोशिप (ALTF-516-2012) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71380 | |
| KCl | Acros Organics | 196770010 | |
| KH2PO4 | AppliChem | A1042 | |
| Na2HPO4 | Acros Organics | 424370025 | |
| Hepes | AppliChem | A3724 | |
| Magnesiun acetate tetrahydrate | Fluka | 63047 | |
| Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A2948 | |
| Imidazole | Sigma-Aldrich | 10125 | |
| NaOH | Fluka | 71690 | |
| Sucrose | Merck Millipore | 107687 | |
| Leupeptin | Roche | 11017101001 | |
| Pepstatin | Roche | 10253286001 | |
| Aprotinin | Roche | 10236624001 | |
| Paraformaldehide | Polysciences. Inc | 380 | |
| Alexa Fluor 555 phalloidin | Molecular Probes | A34055 | |
| Actin rhodamine | Cytoskeleton. Inc | APHR-A | |
| Mowiol 4-88 | Sigma-Aldrich | 81381 | poly(vinyl alcohol), Mw ~31 000 |
| DABCO | Sigma-Aldrich | D-2522 | |
| Tris-HCl | AppliChem | A1086 | |
| β-casein | Sigma-Aldrich | C6905 | |
| Filter 0.22um | Millex | SL6V033RS | |
| Round 10cm dishes for cell culture | Thermo Fisher Scientific | 150350 | |
| Plastic Pasteur pipette | Assistent | 569/3 40569003 | |
| 15-ml polypropylen tube | TPP | 91015 | |
| Hypodermic Needle 22G Black 30mm | BD Microlance | 300900 | |
| Sterile Luer-slip 1ml Syringes without needle | BD Plastipak | 300013 | |
| Micro glass slides | Assistent | 2406 | |
| 18X18-mm glass coverslip | Assistent | 1000/1818 | |
| SW60 centrifuge tube | Beckman coulter | 344062 | |
| TLS-55 centrifuge tube | Beckman coulter | 343778 | |
| 200-μl yellow tip | Starlab | S1111-0706 | |
| 1000-μl Blue Graduated Tip | Starlab | S1111-6801 | |
| 1.5-ml test tube | Axygen | MCT-175-C 311-04-051 | |
| 18-mm diameter round coverslip | Assistent | 1001/18 | |
| 35-mm diameter round dish with a 20-mm glass bottom (0.16-0.19 mm) | In vitro Scientific | D35-20-1.5-N | |
| Refractometer | Carl Zeiss | 79729 | |
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Sorvall WX80 Ultracentrifuge | Thermo Fisher Scientific | 46900 | |
| Tabletop ultracentrifuge | Beckman coulter | TL-100 | |
| SW60 rotor | Beckman coulter | 335649 | |
| TLS-55 rotor | Beckman coulter | 346936 | |
| Confocal microscopy | Carl Zeiss | LSM-780 | |
| Fugene HD transfection reagent | Promega | E2311 | |
| Protein assay reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
| Protein assay reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
| Protein assay reagent S | Bio-Rad | 500-0115 | |
| Cell scraper | Homemade | Silicone rubber piece of about 2 cm, cut at a very sharp angle and attached to a metal bar or held with forceps | |
| Refractometer | Carl Zeiss | ||
| Minimum Essential Medium Eagle (MEM) | Sigma-Aldrich | M0643 | |
| FCS | Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Thermo Fisher Scientific | 11140-035 | |
| L-Glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-024 | |
| Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| pH Meter 691 | Metrohm | ||
| ImageJ software | NIH, Bethesda MD |
References
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