Быстрый и эффективный метод для того чтобы рассечь куколки крылья дрозофилы подходит для Immunodetections или анализы ПЦР
Summary
Способность точно обнаруживать стенограммы или белков в тканях дрозофилы имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития. Вот описание простой процедуры для того чтобы рассечь куколки крылья. Эти крылья могут использоваться в качестве образцов в несколько приемов (иммуногистохимии, ПЦР анализа и т.д.).
Abstract
Крыло развитие в Drosophila melanogaster является идеальной моделью для изучения морфогенеза на тканевом уровне. Эти придатках развиваются из группы клеток, названный крыло имагинальных дисков, сформированные в ходе эмбрионального развития. В личиночной стадии имагинальных дисков растут, увеличивая его количество клеток и формирования однослойное эпителиальных структур. Внутри куколки дела имагинальных дисков бутон и сложите в бислоев вдоль линии, которая становится будущее края крыла. В ходе этого процесса продольной primodia вен возникают Вены клетки на перспективных дорсальной и вентральной поверхности крыла. На стадии куколки полосы вен клеток каждой поверхности общаться с целью создания жесткой трубы; в то же время кросс вен начать их формирования.
С помощью соответствующих молекулярных маркеров это возможно для определения основных элементов, составляющих крыла во время его разработки. По этой причине способность точно обнаруживать стенограммы или белков в этой структуре имеет решающее значение для изучения их изобилие и локализации, связанных с процессом развития крыла.
Процедура описана здесь сосредоточена на манипулирование куколки крылья, предоставляя подробные инструкции о том, как анализировать крыло на стадии куколки. Рассечение куколки ткани сложнее, чем их коллеги в третьего возраста личинок. Вот почему этот подход был разработан, чтобы получить быстрое и эффективное высокое качество образцов. Подробная информация о том, как имунноконтраст и горе эти образцы крыло, чтобы позволить визуализации белки или клеточных компонентов, предоставляются в протоколе. С небольшим опытом можно собрать 8-10 высокое качество куколки крылья в короткий промежуток времени.
Introduction
Дрозофилы крылья развиты из имагинальных дисков крыла. Изначального этих дисков крыла отложить в сторону во время эмбрионального развития как небольшие группы 20-30 имагинальных ячеек из эмбриональных эпителия инвагинировать. В то время как личинка растет на третий этап instar, митоз происходит в имагинальных клеток на конкретных характеристические времена, повышение его номера (около 50000 клетки) и формирования крыло диск1,2,3, 4. Как клетки размножаются, они модные трубчатых эпителия, что приводит к самостоятельной раскладной компактный спираль. В ходе Окукливание эпителий диска Телескопы в виде двухслойной крыло и продольные Вены начать как пробелы между ними, которое происходит дважды в течение крыло развития5,6.
Расположение вен всегда имеет идентичные шаблон; возможность легко определить все изменения в пределах вен образования делает мутации чрезвычайно видимым (например отсутствующие или лишние вен, изменения в духе позиции и т.д.). Интересно, что вариации фенотип обычно являются свидетельством мутаций в известных или Роман компонентов сигнальные пути, которые имеют отношение к развитию крыла. Одним из путей, которые играет определенную роль в определении положения и поддержания вен и intervein территорий является ежа (Hh) путь6,,78.
Учитывая важность куколки крыла как модель системы, это будет важно для получения хорошего качества образцов для работы с. В прошлом ученые, которые опубликованы протоколы для того чтобы рассечь дрозофилы крылья не дали соответствующее руководство для достижения реальных образцов. Без руководства исследователь один нельзя четко визуализировать процесс. В этих альтернативных подходов рассечения куколки разделен на два, отделяя крыло от окружающих тканей и многократно промывают для удаления мусора. Такого рода подход претензий оставить бесплатно крыло загрязняет, но из-за предыдущего опыта процесс медленнее и выше вероятность компрометации структуру хрупких крылья9.
Процедуру, описанную здесь был разработан спроса найти быстрый и эффективный метод для получения образцов куколки крыла, подходящих для выявления специфических белков или стенограммы, протоколы immunodetection или полимеразной цепной реакции (ПЦР) анализов. Чтобы проиллюстрировать это, выражение и локализации заплата (Ptc или канонического рецептор Hh путь) обнаружен в образцах куколки крыла, обеспечивая протокол, который включает в себя соответствующие детали успешно провести полный процедура.
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод вскрытия, описанные в этом видео может использоваться для подготовки образцов высокого качества дрозофилы куколки крыльев от развития различных этапов для многих типов методов (например, иммунофлюоресценции, синтез cDNA в анализы ПЦР, в пробирке крыло развития). С т?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить CSIC за финансовую поддержку этого проекта, Мариана Di Doménico для ее технической помощи конфокальной микроскопии; для Хосе Леонардо Баэс для исправления его рукопись; для Лусиано Корреа за его приверженность созданию видео; для Натальи Rosano для кредитования Блумингтон дрозофилы фондовой центр для обеспечения запасов, используемые в данном исследовании и ее голос для видео. Apa1 моноклонального анти Ptc разработала в Isabel Герреро был получен от развития банка гибридомной исследований (DSHB) под эгидой NICHD и поддерживается университета штата Айова, Отделение биологических наук, Айова-Сити, IA 52242.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O’Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
