Summary

طريقة سريعة وفعالة لتشريح أجنحة المورفولوجية مناسبة إيمونوديتيكشنز أو فحوصات بكر الخوادر

Published: December 30, 2017
doi:

Summary

القدرة على الكشف عن دقة النصوص أو البروتينات في الأنسجة المورفولوجية أمر بالغ الأهمية لدراسة ما وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية. هنا هو وصف لإجراءات واضحة تشريح أجنحة الخوادر. يمكن استخدام هذه الأجنحة كعينات في العديد من التقنيات (إيمونوهيستوتشيميستري، وفحص PCR، إلخ).

Abstract

وضع الجناح في melanogaster المورفولوجية نموذجا مثاليا لدراسة morphogenesis على مستوى الأنسجة. تطوير هذه الملاحق من مجموعة من الخلايا المسماة الجناح أقراص imaginal شكلت أثناء التطور الجنيني. في مراحل اليرقات تنمو أقراص إيماجينال، زيادة في عدد الخلايا وتشكيل هياكل طلائي مونولاييريد. داخل القضية الخوادر، برعم بأقراص إيماجينال وإضعاف في بيلاييرس على طول خط يصبح الهامش مستقبلا من الجناح. أثناء هذه العملية، تنشأ العروق الطولية بريموديا الخلايا المنطلق على السطوح الظهرية والبطني المحتملين من الجناح. خلال مرحلة الخوادر المشارب الخلايا الوريد لكل سطح الاتصال من أجل إنشاء أنابيب ضيقة؛ في الوقت نفسه، تبدأ عبر الأوردة تكونها.

بمساعدة الواسمات الجزيئية الملائمة، من الممكن تحديد العناصر الرئيسية يؤلف الجناح أثناء تطورها. ولهذا السبب، القدرة على دقة الكشف عن وقائع أو البروتينات في هذا الهيكل حاسم بالنسبة للذين يدرسون وفرة والتعريب المتصلة بعملية التنمية للجناح.

ووصف الإجراء هنا يركز على التلاعب بأجنحة الخوادر، توفير إرشادات مفصلة حول كيفية تشريح الجناح خلال مرحلة الخوادر. تشريح الأنسجة الخوادر أكثر صعوبة لأداء نظرائهن في يرقات الطور الثالث. وهذا السبب في وضع هذا النهج، للحصول على عينات سريع وكفاءة عالية الجودة. وترد تفاصيل عن كيفية إيمونوستين وجبل هذه العينات الجناح، للسماح للتصور من البروتينات أو مكونات الخلية، في البروتوكول. مع القليل من الخبرة من الممكن جمع 8-10 أجنحة الخوادر ذات جودة عالية في فترة قصيرة من الزمن.

Introduction

يتم تطوير أجنحة المورفولوجية من أقراص إيماجينال الجناح. البدائي لهذه الأقراص الجناح جانبا أثناء التطور الجنيني كمجموعات صغيرة من الخلايا إيماجينال 20-30 التي إينفاجيناتي من ظهارة الجنينية. بينما تنمو اليرقة إلى مرحلة الطور الثالث، يحدث الانقسام في الخلايا إيماجينال في أوقات محددة مميزة رفع عدد أعضائها (حوالي 50000 الخلايا) وتشكيل الجناح القرص1،2،3، 4. كما تتكاثر الخلايا، أنها أزياء من ظهارة أنبوبي، أدى إلى تصاعد ضغط ذاتية قابلة لطي. أثناء بوباتيون، ظهارة القرص التلسكوبات خارجاً للجناح شكل الطبقات اثنين وعروق طولية تبدأ كثغرات بينهما، الذي يحدث مرتين خلال الجناح الإنمائية5،6.

وقد ترتيب الأوردة دائماً نمط مماثل؛ القدرة على التعرف بسهولة على كل تغيير في تشكيل الأوردة يجعل الطفرات مرئية جداً (مثلاً مفقودة أو إضافية الأوردة، تغييرات في مواقف الوريد، إلخ.). من المثير للاهتمام، اختلافات النمط الظاهري هي عادة أدلة الطفرات في المكونات المعروفة أو الرواية من إشارات المسارات ذات الصلة لتطوير الجناح. واحد من المسارات التي تلعب دوراً في تحديد الموقف والحفاظ على السياق والأراضي إينتيرفين هو القنفذ (ح ح) المسار6،،من78.

ونظرا لأهمية الجناح الخوادر كنظام نموذجي، سيكون من المهم الحصول على عينات ذات نوعية جيدة للعمل مع. في الماضي، لم تول العلماء التي نشرت البروتوكولات تشريح أجنحة المورفولوجية دليلاً مناسباً لتحقيق نماذج قابلة للتطبيق. دون التوجيه من باحث واحد لا يمكن تصور وضوح العملية. في هذه النهج البديل تشريح تقسيم اثنين، الفصل بين الجناح من الأنسجة المحيطة عذراء وغسلها مرارا وتكرارا لإزالة الأنقاض. يلوث هذا النوع من النهج المطالبات بمغادرة الجناح مجاناً للكن العملية أبطأ بسبب التجربة السابقة وهناك فرصة أكبر للمساس بهيكل أجنحة هشة9.

وقد وضعته الإجراء الموضح هنا الطلب لإيجاد وسيلة سريعة وفعالة للحصول على عينات الجناح الخوادر مناسبة للكشف عن بروتينات محددة أو النصوص باستخدام بروتوكولات إيمونوديتيكتيون أو فحوصات بوليميريز سلسلة من ردود الفعل (PCR). ولتوضيح ذلك، التعبير والترجمة من مرقع (المؤسسة العامة للاتصالات أو مستقبلات المتعارف عليه المسار سمو) تكتشف في عينات الجناح الخوادر، توفير بروتوكول يتضمن التفاصيل ذات الصلة القيام بنجاح الكامل الإجراء.

Protocol

1 يوم 1-جمع واستزراع الخوادر. إزالة ح 0 بعد تشكيل بوباريوم (APF) أو بريبوباي باستخدام الرسام رطب من قنينات مثقف ووضعها في قارورة جديدة لإكمال فترة التنمية تقريبا (انظر 2-1 و 2، 2). ملاحظة: ينبغي الإبقاء على صحة سكان من الذباب باستخدام البروتوكولات القياسية تثقيف. ب?…

Representative Results

ويوفر البروتوكول وسيلة مباشرة للحصول على عينات الجناح الخوادر التي تحتفظ مورفولوجية مألوفة للجناح. من هذه الأعمال التحضيرية من الممكن الحصول على أكوام من الصور التي يمكن أن يكون المتوقع كثنائي الأبعاد أو ثلاثي الأبعاد، للتحقيق في توزيع و/أو في إثراء البروتينات خلال الت…

Discussion

يمكن استخدام طريقة التشريح الموصوفة في هذا الفيديو لتحضير عينات ذات جودة عالية من أجنحة المورفولوجية الخوادر من مراحل التنمية المختلفة لأنواع كثيرة من التقنيات (مثلاً، الفلورة، كدنا توليف لفحوصات بكر، في المختبر الجناح التنمية). فيما يتعلق بهذه الطريقة قد استخدمت العلماء…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

ونود أن نشكر السفن للدعم المالي المقدم لهذا المشروع، ماريانا Di Doménico لها المساعدة التقنية مع الفحص المجهري [كنفوكل]؛ لخوسيه ليوناردو باييز التصويبات مخطوطة له؛ لكوريا لوتشيانو لتفانيه في خدمة إنشاء الفيديو؛ إلى ناتاليا Rosano للإقراض صوتها للفيديو و المورفولوجية بلومينغتون مركز الأوراق المالية توفير الأرصدة المستخدمة في هذه الدراسة. حصل من الضفة هيبريدوما الدراسات الإنمائية (دشب) تحت إشراف NICHD Apa1 [مونوكلونل] مكافحة–المؤسسة العامة للاتصالات المتقدمة من إيزابيل غيريرو ويحتفظ بها جامعة آيوا، قسم العلوم البيولوجية، 52242 مدينة آيوا، ألف.

Materials

Stereomicroscope with cool light illumination Nikon  SMZ1000
Rocking platform Biometra (WT 16) 042-500
Microscope slides StarFrost 8037/1
Cover glasses (24 x 32 mm) Deltalab D102432
Forceps F.S.T 11252-00
Scissors Lawton 63-1400
Multi-well plastic dish Thermo Scientific 144444
p100 or p200 pipette Finnpipette (Labsystems) 9400130
1X PBS (Dulbecco) Gibco 21600-010
4% paraformaldehyde  Sigma 158127
Triton X-100 Sigma T8787
BSA Bio Basic INC. 9048-46-8
Glycerol Mallinckrodt 5092
Tris Amresco 497
TRIzol Reagent Ambion 15596026
DEPC treated water MO.BIO 17011-200
Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL
(working dilution 1/800)
Invitrogen A11030
Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL
(working dilution 1/100)
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. 
DAPI, 1 mg/mL
(working dilution 1/5000)
Invitrogen 62248
Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol
(1/600 working dilution)
Invitrogen A12379
Canton S (fly stock) Bloomington Drosophila Stock Center 

References

  1. Serrano, N., O’Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
  2. Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
  3. Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
  4. Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
  5. De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
  6. Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
  7. Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
  8. De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
  9. Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
  10. Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
  11. Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).

Play Video

Cite This Article
Bolatto, C., Parada, C., Colmenares, V. A Rapid and Efficient Method to Dissect Pupal Wings of Drosophila Suitable for Immunodetections or PCR Assays. J. Vis. Exp. (130), e55854, doi:10.3791/55854 (2017).

View Video