Immunodetections または PCR の試金に適したショウジョウバエの蛹の翼を解剖する迅速かつ効率的な方法
Summary
正確にショウジョウバエのティッシュの成績証明書または蛋白質を検出する能力は、その豊かさとローカライズ開発プロセスに関連の勉強にとって重要です。ここ蛹翼を分析する簡単な手順の説明です。これらの翼は、いくつかのテクニック(免疫組織化学、PCR 法等)のサンプルとして使用できます。
Abstract
キイロショウジョウバエの翼の開発は、組織レベルでの形態形成を研究するための理想的なモデルです。これらの肢は、翅成虫原基萌芽期の開発の間に形成の名前セルのグループから開発します。幼虫の段階で成虫原基の成長、細胞の数の増加と単層上皮構造を形成します。蛹のケース内成虫ディスクはうち芽、翼の今後のマージンになりますラインに沿って二重に折る。このプロセス中には、縦 primodia 静脈静脈翼の将来の背側と腹側の表面に細胞を起源としています。蛹の段階で各表面の静脈細胞のストライプのタイトなチューブを生成するために通信します。同時にクロス静脈の形成を開始します。
適切な分子マーカーの助けを借りて、その開発中に翼を構成する主要な要素を識別することが可能です。このため、正確にこの構造体の成績証明書または蛋白質を検出する能力は、彼らの豊かさと翼の開発プロセスに関連するローカリゼーションを勉強するため重要です。
手順は、蛹の段階で翼を分析する方法の詳細な手順を提供して、蛹の翼を操作することに焦点を当ててを紹介します。蛹の組織の郭清は 3 齢幼虫での対応よりも難しくなります。これは、迅速かつ効率的な高品質なサンプルを取得するこの方法を開発した理由です。Immunostain とマウントする方法の詳細について蛋白質または細胞のコンポーネントの可視化できるように、これらの翼サンプルは、プロトコルで提供されます。少しの専門知識を持つ 8-10 高品質蛹翼を短時間で収集することが可能です。
Introduction
ショウジョウバエ羽翅成虫原基から開発されています。これらの翼のディスクの原初は、胚上皮から鞘に収めた 20 30 成虫細胞の小さなグループとして萌芽期の開発の間に脇に置きます。有糸分裂がディスク1,2,3、その数 (約 50000 細胞) を上げると翼を形成特性の特定の時間に成虫細胞に発生する幼虫が 3 令期に高まる一方 4。細胞の増殖、彼らの自己折りたたみコンパクトなスパイラルの結果、尿細管上皮をファッションします。蛹化、ディスク上皮は 2 層フォーム翼に望遠鏡を縦方向の静脈は、翼発達5,6の中に 2 回発生するそれらの間の腔として起動。
常に静脈の配列が同一のパターン;静脈形成内すべての変化を簡単に識別できる変異非常に目に見える (例えば行方不明または余分な静脈、静脈の位置等の変更。) になります。興味深いことに、表現型変化、通常知られているまたは新しいコンポーネント翼開発に関連するシグナルの突然変異の証拠です。位置の決定、静脈と intervein 地域を維持する役割を果たしている経路の 1 つはハリネズミ (Hh) 経路6,7,8です。
モデル システムとして蛹翅の重要性を考えると、それはで動作するように良い品質のサンプルを得ることが重要なります。過去には、ショウジョウバエのハネを解剖するためのプロトコルを公開している科学者実行可能なサンプルを達成するために適切なガイドを与えていません。研究者の指導なし 1 つ明確にプロセスを視覚化することはできません。これらの代替解剖アプローチの蛹は周囲の組織から分離すること、2 つの翼に分割、瓦礫の撤去には繰り返し洗浄します。この種類の自由の翼を残す方法クレームの汚染しますが、以前の経験のために、処理が遅くなります、壊れやすい翼9の構造を損なうことのより高いチャンスがあります。
ここで説明する手順は、蛹翅サンプルの特定の蛋白質や謄本バイオアセッテイ プロトコルまたはポリメラーゼの連鎖反応 (PCR) の試金を使用しての検出に適してを取得する高速かつ効率的な方法を見つけるための需要によって開発されました。式およびパッチ適用 (Ptc または Hh 経路の正規受容体) のローカリゼーション、これを説明するためにが正常に完全なを実行する関連する詳細情報を含むプロトコルを提供する蛹翅のサンプルで検出されました。プロシージャ。
Protocol
Representative Results
Discussion
郭清はこのビデオで説明されているメソッドを使用して、技術の多くの種類の別の開発段階からショウジョウバエ蛹翼の高品質なサンプルを準備できます (例えば、蛍光抗体法、PCR の試金、cDNA 合成in vitro における翼の開発)。このメソッドの面で関与する科学者は 24-30 h APF を使用しています。しかし若いまたは古い蛹の郭清に不可欠なステップ以内の障害はないはず。変…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
CSIC マリアナ ・ ディ ・ Doménico の共焦点顕微鏡と彼女のテクニカル サポートをこのプロジェクトに与えられた財政援助のために感謝したいと思いますホセ レオナルドあった彼の原稿の修正; のためにルチアーノ ・ コレア、ビデオの作成に彼の献身のために貸出ビデオのための彼女の声と本研究で使用される株式を提供するブルーミントンショウジョウバエストック センターのナタリア Rosano。イザベル ゲレロによってモノクローナル抗 ptc Apa1 は、発育の後援の下から発達研究ハイブリドーマ銀行 (DSHB) が取得・保有アイオワの大学、生物科学専攻、アイオワ ・ シティ、IA 52242。
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O’Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
