En snabb och effektiv metod att dissekera Pupp vingar av Drosophila lämplig för Immunodetections eller PCR-analyser
Summary
Förmågan att korrekt upptäcka avskrifter eller proteiner i Drosophila vävnader är kritisk för att studera deras överflöd och lokalisering relaterade till utvecklingsprocessen. Här är beskrivningen av en enkel procedur att dissekera Pupp vingar. Dessa vingar kan användas som prover i flera tekniker (immunohistokemi, PCR-analys, etc.).
Abstract
Påskyndar utvecklingen i Drosophila melanogaster är en idealmodell för att studera morfogenes på vävnaden nivå. Dessa bihang utvecklas från en grupp av celler som heter wing imaginal skivor bildas under fosterutvecklingen. I larval arrangerar växa imaginal skivorna, öka sitt antal celler och bildar monolayered epiteliala strukturer. Inne i det Pupp, imaginal skivorna bud ut och vika in lipidmonolager längs en linje som blir framtida marginalen av vingen. Under den här processen kommer längsgående primodia venerna ven celler på blivande dorsala och ventrala ytor av vingen. Under Pupp scenen kommunicera ränder av ven celler av varje yta för att generera trånga rör; på samma gång börjar cross-venerna sin bildning.
Med hjälp av lämpliga molekylära markörer är det möjligt att identifiera de viktigaste inslagen komponera vingen under dess utveckling. Av denna anledning är förmågan att korrekt upptäcka avskrifter eller proteiner i denna struktur avgörande för att studera deras överflöd och lokalisering relaterade till utvecklingsprocessen av vingen.
Förfarandet beskrivs här fokuserar på att manipulera Pupp vingar, att ge detaljerade instruktioner om hur att dissekera vingen under Pupp scenen. Dissektion av Pupp vävnad är svårare att utföra än deras motsvarigheter i tredje instar larver. Det är därför detta tillvägagångssätt utvecklades, för att få snabb och effektiv hög kvalitet prover. Detaljer om hur man immunostain och montera dessa wing prover, att tillåta visualisering av proteiner eller cell komponenter, finns i protokollet. Med lite expertis är det möjligt att samla in 8-10 hög kvalitet Pupp vingar i en kort tid.
Introduction
Drosophila vingar är utvecklade från wing imaginal skivorna. Primordial av skivorna wing är gallrat under den embryonala utvecklingen som små grupper av 20-30 imaginal celler som invaginate från embryonala epitel. Medan larven växer till den tredje etappen instar, sker Mitos i imaginal cellerna vid särskilda karakteristiska gånger höja dess nummer (cirka 50000 celler) och bildar vingen skiva1,2,3, 4. Som cellerna föröka, mode de en tubulär epitel, vilket resulterade i en egen fällbara compact spiral. Under förpuppningen, skiva epitelet teleskop ut till form i två lager wing och längsgående venerna start som luckor mellan dem, som inträffar två gånger under vingen utvecklingsmässiga5,6.
Arrangemanget av venerna alltid har ett identiskt mönster; möjligheten att enkelt identifiera varje ändring inom vener bildandet gör mutationer extremt synliga (t.ex. saknas eller extra vener, förändringar i ven positioner, etc.). Intressant, är fenotyp variationerna oftast bevis på mutationer i kända eller nya komponenter av signalering vägar som är relevanta för wing utveckling. En av de vägar som spelar en roll i att bestämma position och underhålla ven och intervein territorier är igelkott (Hh) väg6,7,8.
Med tanke på betydelsen av Pupp vingen som modellsystem, blir det viktigt att få bra kvalitet prover att arbeta med. Tidigare har forskare som har publicerade protokoll att dissekera Drosophila vingar inte gett en lämplig guide att uppnå fungerande prover. Utan ledning av en forskare kan inte en tydligt visualisera processen. I dessa alternativa dissekera synsätt är puppan delad i två, separera vingen från omgivande vävnad och tvättas upprepade gånger för att ta bort skräpet. Detta slags tillvägagångssätt påståenden att lämna vingen gratis förorenar men på grund av tidigare erfarenheter processen är långsammare och det finns en större chans att kompromissa strukturen för den sköra vingar9.
Proceduren som beskrivs här utvecklades av efterfrågan för att hitta en snabb och effektiv metod för att erhålla Pupp wing prover lämpliga att upptäcka specifika proteiner eller avskrifter med immunodetection protokoll eller polymeras-kedjereaktion (PCR) analyser. För att illustrera detta, uttryck och lokalisering av Patched (Ptc eller kanoniska receptorn av Hh-vägen) upptäcks i Pupp wing prover, som tillhandahåller ett protokoll som innehåller relevanta detaljer att framgångsrikt genomföra den kompletta förfarandet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden av dissektion som beskrivs i denna video kan användas för att förbereda hög kvalitet prover Drosophila Pupp vingar från olika utvecklingsstadier för många typer av tekniker (t.ex. immunofluorescens, cDNA syntes till PCR-analyser, in vitro- wing utveckling). När det gäller denna metod har forskare inblandade använt 24-30 h APF. Men det bör finnas något hinder inom grundläggande stegen i dissekering av yngre eller äldre puppa. Ändringar kan behöva göras för att tillgodo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka CSIC för det finansiella stödet till detta projekt, att Mariana Di Doménico för hennes tekniskt bistånd med konfokalmikroskopi; att José Leonardo Báez för hans manuskript korrigeringar; att Luciano Correa för hans hängivenhet till skapandet av video; att Natalia Rosano för utlåning hennes röst för video och Bloomington Drosophila lager Center för att tillhandahålla de lager som används i denna studie. Den Apa1 monoklonala anti-Ptc utvecklat av Isabel Guerrero var erhållits från den utvecklande studier Hybridomteknik Bank (DSHB) under överinseende av NICHD och underhålls av The University of Iowa, Institutionen för biologiska vetenskaper, Iowa City, IA 52242.
Materials
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ1000 | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Microscope slides | StarFrost | 8037/1 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Forceps | F.S.T | 11252-00 | |
| Scissors | Lawton | 63-1400 | |
| Multi-well plastic dish | Thermo Scientific | 144444 | |
| p100 or p200 pipette | Finnpipette (Labsystems) | 9400130 | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| 4% paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| TRIzol Reagent | Ambion | 15596026 | |
| DEPC treated water | MO.BIO | 17011-200 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-mouse IgG (H+L), 2 mg/mL (working dilution 1/800) |
Invitrogen | A11030 | |
| Monoclonal anti-Ptc (Apa-1) 54 μg/mL (working dilution 1/100) |
Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) | By Isabel Gerrero from DSHB under the auspices of the NICHD and maintained by The University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242. | |
| DAPI, 1 mg/mL (working dilution 1/5000) |
Invitrogen | 62248 | |
| Phalloidin conjugated to Alexa 488, 300 U/1.5 mL methanol (1/600 working dilution) |
Invitrogen | A12379 | |
| Canton S (fly stock) | Bloomington Drosophila Stock Center |
References
- Serrano, N., O’Farrell, P. H. Limb morphogenesis: connections between patterning and growth. Curr Biol. 7 (3), R186-R195 (1997).
- Blair, S. S. Compartments and appendage development in Drosophila. Bioessays. 17 (4), 299-309 (1995).
- Klein, T. Wing disc development in the fly: the early stages. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 470-475 (2001).
- Beira, J. V., Paro, R. The legacy of Drosophila imaginal discs. Chromosoma. 125 (4), 573-592 (2016).
- De Celis, J. F., Diaz-Benjumea, F. J. Developmental basis for vein pattern variations in insect wings. Int J Dev Biol. 47 (7-8), 653-663 (2003).
- Blair, S. S. Wing vein patterning in Drosophila and the analysis of intercellular signaling. Annu Rev Cell Dev Biol. 23, 293-319 (2007).
- Bier, E. Drawing lines in the Drosophila wing: initiation of wing vein development. Curr Opin Genet Dev. 10 (4), 393-398 (2000).
- De Celis, J. F. Pattern formation in the Drosophila wing: The development of the veins. Bioessays. 25 (5), 443-451 (2003).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol Biol. 420, 265-275 (2008).
- Bolatto, C., et al. Spatial and temporal distribution of Patched-related protein in the Drosophila embryo. Gene Expr Patterns. 19 (1-2), 120-128 (2015).
- Zuniga, A., et al. Genes encoding novel secreted and transmembrane proteins are temporally and spatially regulated during Drosophila melanogaster embryogenesis. BMC Biol. 7, 61 (2009).
