Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

توليف الكيماوي الانزيمية من N-جليكانس للتنمية الصفيف وأضداد الفيروس التنميط

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

نهج نموذجي لتوليف N-جليكانس للتمسك زجاج معدني مغلف بأكسيد الألومنيوم الشريحة (شريحة ACG) كما تم وضع ميكرواري جليكان وقد ثبت استعماله للتنميط فيروس نقص المناعة البشرية على نطاق واسع تحييد الأجسام المضادة.

Abstract

نتقدم بطريقة ذات كفاءة عالية للتحضير السريع لمجموعة واسعة النطاق من N-ترتبط oligosaccharides (يقدر أن يتجاوز هياكل 20,000) التي توجد عادة في جليكوبروتينس البشرية. لتحقيق التنوع الهيكلي المطلوب، بدأت الاستراتيجية مع توليف الكيماوي الانزيمية لثلاثة أنواع من وحدات فلوريد أوليجوساكتشاريل، تليها بهم جليكوسيليشنز α-انتقائية التدرجي في 3-O و 6-يا مناصب يطلق بقايا من تريساكتشاريدي الأساسية المشتركة وجود صلة حاسمة β-مانوسيدي. نحن كذلك تعلق N-جليكانس على سطح شريحة زجاجية المغلفة بأكسيد الألومنيوم (ACG) لإنشاء مجموعة مختلطة التساهمية لتحليل التفاعل هترو-يجند مع جسم فيروس نقص المناعة البشرية. على وجه الخصوص، بسلوك ملزمة المعزولة حديثا فيروس نقص المناعة البشرية-1 على نطاق واسع من تحييد جسم (بناب)، PG9، إلى الخليط من رجل المتقاربة5جلكناك2 (رجل5) ومجمع ثنائي أنتيناري 2، 6-دي-سياليلاتيد اكتب N-جليكان (SCT ) على صفيف ACG، يفتح سبيلاً جديداً لتوجيه تصميم إيمونوجين فعالة لتطوير لقاحات فيروس نقص المناعة البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، لدينا مجموعة ACG يجسد أداة قوية لدراسة أخرى الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية لسلوك ملزم يجند المتغايرة.

Introduction

N-جليكانس على جليكوبروتينس تساهمي ترتبط أسباراجين بقايا (Asn) من سكون Asn-الثلاثون-Ser/الثريونين إلى توافق في الآراء، التي تؤثر على العديد من العمليات البيولوجية مثل الاعتراف أنتيجينيسيتي والذوبان، تكيف ويكتين البروتين 1 , 2-التوليف الكيميائي من N-oligosaccharides مرتبط تمثل تحديا كبيرا اصطناعية بسبب التباين الجزئي الهيكلي ضخمة وهندسة عالية متفرعة. الاختيار الدقيق لحماية مجموعات لضبط مفاعليه لبنات البناء، تحقيق الانتقائية في مراكز أنوميريك، والاستخدام السليم للمروج/activator(s) عناصر رئيسية في توليف oligosaccharides المعقدة. لحل هذه المشكلة من التعقيد، وقدرا كبيرا من العمل للنهوض بتوليف-جليكان نذكر مؤخرا3،4. وعلى الرغم من هذه النهج قوية، إيجاد طريقة فعالة لإعداد مجموعة واسعة من N-جليكانس (~ 20,000) ما زال تحديا رئيسيا.

معدل الطفرات السريعة لفيروس نقص المناعة البشرية-1 تحقيق التنوع الوراثي الواسعة وقدرته على الهروب من تحييد استجابة الأجسام المضادة، من بين أكبر التحديات التي تواجه تطوير لقاح أمن والوقاية ضد فيروس نقص المناعة البشرية-15،6 , 7-تكتيك فعال واحد يستخدم فيروس نقص المناعة البشرية لتجنب الاستجابة المناعية المضيف هو جليكوسيليشن بوستترانسلاشونال من المظروف بروتين سكري gp120 مع أحد متنوعة ن-مرتبطة جليكانس المستمدة من المضيف glycosylation إليه8، 9. تقرير صدر مؤخرا فيما يتعلق بتحليل دقيق لفيروس نقص المناعة البشرية-1 أحادي المؤتلف gp120 glycosylation من الخلايا 293T الكلي الجنينية البشرية (HEK) يوحي بحدوث ميكروهيتيروجينيتي الهيكلية مع مميزة الخاصة بخلية نمط10 , 11 , 12-ولذلك، فهم خصوصيات جليكان بنابس فيروس نقص المناعة البشرية-1 يتطلب كذلك تتسم gp120 المتعلقة بهياكل-جليكان نبكميات كافية للتحليل.

قدم اكتشاف جليكان ميكرواري تكنولوجيا الاستكشاف المستندة إلى إنتاجية عالية من الخصائص المميزة لمجموعة متنوعة من البروتينات الكربوهيدرات ملزم، أدهيسينس الفيروسات/البكتيريا والسموم، والأجسام المضادة ولكتينس13،14 . يمكن تحديد هذا الترتيب المنهجي جليكانس في شكل القائم على رقاقة arrayed إشكالية تقارب منخفضة البروتين-جليكان التفاعلات من خلال عرض متعددي15،16،،من1718. يظهر هذا الترتيب القائم على رقاقة جليكان مريح فعالية تحاكي واجهات خلية خلية. لإثراء هذه التكنولوجيا والتغلب على مسألة تفاوت المرتبطة بصيغ الصفيف التقليدية، مجموعتنا مؤخرا بوضع مصفوفة جليكان على شريحة زجاج المغلفة بأكسيد الألومنيوم (ACG) استخدام جليكانس المنتهية في حمض الفوسفونيك لتعزيز كثافة إشارة، التجانس، وحساسية19،20.

لتحسين التفاهم الحالية حول [ابيتوبس] جليكان حديثا عزل فيروس نقص المناعة البشرية-1 تحييد الأجسام المضادة (بنابس) على نطاق واسع، قمنا بتطوير استراتيجية وحدات ذات كفاءة عالية لإعداد مجموعة واسعة من N-يرتبط جليكانس21 ،22 لتتم طباعتها على ACG الشريحة (انظر الشكل 1). خصوصية عرضت دراسات التنميط لفيروس نقص المناعة البشرية-1 بنابس في صفيف ACG الكشف غير عادية من سلوك ربط هترو-جليكان من بناب قوية للغاية PG9 التي كانت معزولة من فيروس نقص المناعة البشرية إصابة الأفراد23،،من2425.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-إعداد D1/D2 تسليح الوحدات22

  1. إعداد الوسيطة 2
    1. وزن ابتداء من المواد 1 (هو مبين في الشكل 2، ف-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 مغ، 0.204 ملمول)) في أنبوب 15 مل وتذوب في تريس الذي يحتوي على المخزن المؤقت (25 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5) كلوريد المنغنيز (الحركة2، 10 ملم) لتحقيق تركيز جليكان نهائي من 5 ملم.
    2. إضافة 2 مكافئات أردين diphosphate اللبن (UDP-غال).
    3. إضافة 150 وحدة من إنزيم بيتا-1، 4 ترانسفيراسيس جالاكتوسيل من حليب البقر، واحتضان المخلوط في 37 سج عن ح 15.
    4. بعد 15 ح، أداء طبقة رقيقة اللوني (TLC) للإشارة إلى إجمالي الاستهلاك من بدء تشغيل المواد باكتشاف الخليط رد فعل على صفيحة TLC، وضع مع ن-حمض الخليك/وبيوتانول/المياه (ح2س) في 1:1: نسبة 1 وتلطيخ من حل موليبدات أمونيوم سيريوم 0.25 م متبوعاً بالتدفئة. ثم إخماد رد فعل من التدفئة في 90 سج لمدة 5 دقائق.
    5. الطرد المركزي خليط رد الفعل بسرعة 2,737 ز س لمدة 3 دقائق، وتحميل المادة طافية في الجزء العلوي من العمود جل polyacrylamide (انظر الجدول للمواد). الوت عمود باستخدام الماء المقطر الشطب المتأين، وجمع المنتج مع كسور من 1-2 مل.
    6. رصد الكسور التي تم جمعها عن طريق TLC26، وضع مع ن-butanol: H2o: حمض الخليك في 1:1: نسبة 1، وتلطيخ بحل موليبدات أمونيوم سيريوم متبوعاً بالتدفئة. ليوفيليزي27 المنتج الذي يحتوي على كسور للحصول على متوسط 2 (115 ملغ، 86 في المائة) كمسحوق أبيض. تميز المنتج بالرنين المغناطيسي النووي28 والتحليل الطيفي الشامل29 (انظر ملف البيانات التكميلية).
  2. إعداد 3 متوسطة
    1. وزن ابتداء من المواد 2 (هو مبين في الشكل 2، ف-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 ملغ، 0.122 ملمول)) في أنبوب 15 مل وتذوب في تريس المخزن المؤقت (25 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5) التي تحتوي على الحركة2 (10 مم) لإعداد تركيز جليكان نهائي من 5 مم.
    2. إضافة 2 مكافئات جانسين ثنائي 5 '-ديفوسفو-β-L-فوكس الملح (الناتج المحلي الإجمالي-الجبهة).
    3. إضافة 150 وحدة من إنزيم α-1، ترانسفيراسيس فوكوسيل 3 من الملوية البوابية (Hp1-3FTΔ26695)، واحتضان المخلوط في 37 سج عن ح 15.
    4. اتبع الخطوة 1.1.4.
    5. اتبع الخطوة 1.1.5.
    6. اتبع الخطوة 1.1.6 للحصول على متوسط 3 (مغ 82، 84%) كمسحوق أبيض. تميز المنتج بالرنين المغناطيسي والتحليل الطيفي الجماعي (انظر ملف البيانات التكميلية).
  3. إعداد وحدات 4 و 5
    1. وزن المركبة 2، ف-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (ز 0.230، ملمول 0.360) أو مركب 3، ف- methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (ز 0.100، ميللي مول 0.125) إلى 25 مل واحد-رقبته قارورة مستديرة القاع والجاف تحت الفراغ لمدة 30 دقيقة.
    2. إزالة قارورة من الفراغ وملئه بغاز النيتروجين، وإضافة شريط إثارة مغناطيسية، كاب مع الغشاء المطاطي وإرفاق بالون نيتروجين.
    3. حقن 7 مل بيريدين الجافة و 3 مل من أنهيدريد الخل (Ac2س) في قارورة يوضع في حمام الثلج في 0 سجيم إثارة رد فعل الناتجة عن ح 12 في درجة حرارة الغرفة باستخدام محرض مغناطيسي من 600-700 لفة في الدقيقة. تتبخر المذيبات استخدام منظمة روتاري المبخر عند ضغط فراغ من 0-10 [مبر] في 50 سجيم
    4. تمييع الخليط الخام باستخدام 30 مل الميثان (DCM) واستخراج مع كربونات هيدروجين الصوديوم المائية المشبعة (ناكو3) (2 × 20 مل) في قمع سيباراتوري 50 مل.
    5. إعادة استخراج الطبقة المائية مع DCM (3 × 15 مل) وجاف الطبقات العضوية مجتمعة فوق كبريتات الصوديوم. إزالة كبريتات الصوديوم عن طريق الترشيح ويغسل مع DCM (5 مل). تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 400 [مبر] ضغط فراغ في 40 سجيم
    6. تحميل الحل مزيج النفط الخام إلى 2 مل DCM على رأس السرير والسليكا.
    7. الوت العمود مع خليط يحتوي على والتولوين، والاسيتون من 0-20% الأسيتون في والتولوين وجمع كسور من 5-10 مل.
    8. رصد الكسور التي تم جمعها قبل TLC (الخطوات 1.1.4 و1-1-6)، وضع مع التولوين/الأسيتون (7/3)، وتلطيخ مع حل موليبدات أمونيوم سيريوم تليها تدفئة على طبق ساخن.
    9. تتبخر المنتج الذي يحتوي على كسور استخدام مبخر دوراني للحصول على المنتجات المطلوبة رغوة بيضاء في 72 في المائة والغلال 85 في المائة، على التوالي.
    10. حل المنتجات إلى 7 مل من الاسيتو الانيتريل: التولوين: ح2س 4: نسبة 2:1 في قارورة أسفل جولة 25 مل.
    11. إضافة نترات الأمونيوم السيريوم (المعادل 2) أثناء التبريد إلى 0 سج استخدام حمام الثلج. إثارة رد فعل في درجة حرارة الغرفة ح 3 ~ 500-800 لفة في الدقيقة.
    12. بعد TLC يشير إلى مجموع استهلاك ابتداء من المواد (TLC النامية مع التولوين/الأسيتون (7/3) وتصور بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر أو تلطيخ مع حل موليبدات أمونيوم سيريوم متبوعاً بتدفئة)، تضعف خليط التفاعل مع خلات الإيثيل (30 مل) واستخراج مع ح2س (15 × 2 مل).
    13. استخراج الطبقات العضوية المشتركة مع 5 مل من محلول كلوريد الصوديوم المشبعة (كلوريد الصوديوم).
    14. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 240 [مبر] ضغط فراغ في 40 سجيم
    15. تحميل الحل من النفط الخام المنتج في 2 مل DCM على رأس السرير والسليكا. الوت العمود مع خليط يحتوي على والتولوين، والاسيتون (0-20% الأسيتون، في التولوين) وجمع كسور من 5-10 مل. رصد الكسور التي تم جمعها قبل TLC، وضع مع التولوين/الأسيتون (7/3).
    16. تتبخر الكسور التي تحتوي على المنتج استخدام مبخر دوراني في 77 [مبر] فراغ و 40 سج للحصول على المنتجات المطلوبة رغاوي بيضاء.
    17. حل الكحول كل منهما إلى 10 مل DCM في قارورة مستديرة القاع واحد-رقبته 25 مل وباردة إلى-30 ياجيم
    18. إضافة فلوريد ثلاثي ديثيلامينوسولفور (دست، مكافئات 2). يقلب الخليط رد فعل في-30 سج عن ح 2.
    19. بعد TLC يشير إلى استهلاك ابتداء من المواد (TLC النامية مع التولوين/الأسيتون (4/1) وتصور بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر أو تلطيخ مع حل موليبدات أمونيوم سيريوم متبوعاً بتدفئة)، يضعف رد فعل المخلوط مع DCM (30 مل) ، والمياه والصرف الصحي مع المشبعة ناكو3 (15 × 2 مل).
    20. استخراج الطبقة العضوية المشتركة مع 5 مل محلول كلوريد الصوديوم المشبعة والجافة عن طريق إضافة سلفات المغنيزيوم اللامائى وتصفية الخليط عقب يغسل مع DCM (5 مل) وأنه جمع في قارورة مستديرة القاع واحد-رقبته 100 مل.
    21. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 400 [مبر] ضغط فراغ في 40 سجيم
    22. تحميل الحل من النفط الخام المنتج في 2 مل DCM على رأس السرير والسليكا. الوتي العمود باستخدام خليط من والتولوين، والاسيتون (0-20% الأسيتون في التولوين) والكسور جمع 5-10 مل.
    23. رصد الكسور التي تم جمعها قبل TLC، وضع مع التولوين/الأسيتون (7/3).
    24. تتبخر المنتج الذي يحتوي على كسور استخدام مبخر دوراني للحصول على المنتجات المطلوبة 4، [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- س-ترياسيتيل-α-د-مانوبيرانوسيل الفلوريد (54% عن الخطوات 2) و 5، [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- فلوريد 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl (67% عن الخطوات 2) كالمواد الصلبة البيضاء.
    25. تميز المنتج بالرنين المغناطيسي والتحليل الطيفي الجماعي (انظر ملف البيانات التكميلية).

2-إعداد جليكان 10

  1. إعداد intermidiate 7
    1. وزن الفضة تريفلات كلوريد bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) (أجوتف) (0.039 ز، 0.155 ملمول)، (Cp2هفكل2) (0.041 ز، ملمول 0.108) في قارورة مستديرة القاع واحد-رقبته 25 مل، الجافة تحت فراغ خط شلينك لمدة 30 دقيقة، وإزالته من فراغ، وملئه بغاز النيتروجين.
    2. نقل المجفف الطازج 4 Å الجزيئية ثقب سيتا (0.2 g) في قارورة تحتوي على أجوتف وحزب المحافظين2هفكل2وإضافة شريط المغناطيسي إثارة وكاب مع حاجز الفور وإضافة بالون النيتروجين.
    3. تحويل التولوين الجافة 3 مل إلى قارورة مع حقنه زجاجية جافة. يقلب الخليط رد فعل ح 1 في درجة حرارة الغرفة وبارد ثم إلى 0 ياجيم
    4. حقن حلاً المانحة 4 (الشكل 2، ز 0.043، ملمول 0.046) ويقبلون 6، 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (الشكل 3، ز 0.045، 0.031 ملمول) في 3 مل التولوين في قارورة من خلال حاجز استخدام حقنه 10 مل 0 o جيم إثارة رد فعل الخليط في درجة حرارة الغرفة ح 3.
    5. بعد TLC يشير إلى استهلاك المواد الأولية (TLC، البلدان النامية مع DCM/الأسيتون (8.5/1.5) وتصور بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر أو تلطيخ مع حل موليبدات أمونيوم سيريوم متبوعاً بتدفئة)، إخماد رد فعل بالحقن 10 معادلات لرباعي الإيثيل أمين.
    6. تصفية ثقب سيتا الجزيئية عن طريق سرير سليت في قارورة القاع المستديرة 50 مل، وكذلك يغسل مع 10 مل خلات الإيثيل. استخراج الطبقات العضوية مجتمعة مع حل مشبعة مائي ناكو3 (2 × 20 مل) في قمع سيباراتوري 50 مل. استخراج الطبقة المائية مع وخلات الإيثيل (3 × 15 مل).
    7. استخراج الطبقات العضوية مجتمعة مع محلول كلوريد الصوديوم المشبعة (5 مل)، الجافة باستخدام سلفات المغنيزيوم اللامائى، تصفية الخليط إزالة سلفات المغنزيوم وتغسل مع وخلات الإيثيل (3 × 15 مل) جمع فيلتراتي في قارورة القاع المستديرة 100 مل.
    8. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 240 [مبر] ضغط فراغ في 40 سجيم
    9. تحميل الحل من النفط الخام المنتج في DCM على رأس العمود سرير والسليكا. الوت العمود مع خليط يحتوي على DCM والاسيتون (0-10% الأسيتون في DCM) وجمع كسور من 5-10 مل.
    10. رصد الكسور التي تم جمعها قبل TLC، وضع مع DCM/الأسيتون (8.5/1.5). تتبخر الكسور التي تحتوي على المنتج باستخدام مبخر دوراني للحصول على [intermidiate 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 7، 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-تريتشلوروثوكسي) كاربونيلامينو-β-د-جلوكوبيرانوسيدي (0.052 ز، 70%)، رغوة بيضاء.
    11. تميز المنتج بالرنين المغناطيسي والتحليل الطيفي الجماعي (انظر ملف البيانات التكميلية).
  2. إعداد intermidiate 8
    1. تزن هيكساساكتشاريدي 7 (الشكل 3، ز 0.040، 0.016 ميللي مول) في قارورة مستديرة القاع واحد-رقبته 25 مل والجافة تحت الفراغ ح 1، إزالته من فراغ، وملئه بغاز النيتروجين، إضافة شريط إثارة مغناطيسية، وكاب مع الغشاء المطاطي.
    2. نقل 3 مل acetonitrile:methanol (ميوه) (نسبة 2:1) إلى قارورة.
    3. إضافة فمونوهيدرات حامض السلفونيك التولوين (ز 0.001، ملمول 0.008) في قارورة رد فعل وآثاره رد فعل 800 لفة في الدقيقة ح 5.
    4. بعد TLC يشير إلى استهلاك من ابتداء من المواد (TLC، وضع مع DCM/الأسيتون (8.5/1.5)، وتصور بامتصاص الأشعة فوق البنفسجية في 254 نانومتر أو تلطيخ مع حل موليبدات أمونيوم سيريوم متبوعاً بتدفئة)، إخماد رد فعل بالحقن 10 معادلات لرباعي الإيثيل أمين.
    5. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 337 [مبر] ضغط فراغ في 40 سجيم
    6. حل الخليط الخام مع حوالي 2 مل DCM وتحميله على رأس السرير والسليكا.
    7. الوتي العمود باستخدام خليط من DCM والاسيتون (0-10% الأسيتون في DCM) والكسور جمع 5-10 مل. رصد الكسور التي تم جمعها قبل TLC، وضع مع DCM/الأسيتون (8.5/1.5). تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 400 [مبر] فراغ و 40 سجيم
    8. الجاف لبقايا تحت ضغط انخفاض إعطاء متوسط 8، 5-أزيدوبينتيل-س-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-س-أسيتيل-4, 6-س-بينزيليديني-β-مانوبيرانوسيل د----(1→4)-O-(3.6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (الشكل 3، ز 0.022، 57 في المائة) صلبة بيضاء. تميز المنتج بالرنين المغناطيسي والتحليل الطيفي الجماعي (انظر ملف البيانات التكميلية).
  3. إعداد intermidiate 9
    1. وأنجز إعداد intermidiate 9 (الشكل 3) استخدام المانحة 5 (ز 0.015، 13.2 µmol) ويقبلون 8 (الشكل 3، 0.020 ز، 8.80 µmol).
    2. أجوتف (ز 0.011، 44.1 µmol) و Cp2هفكل2 (0.012 ز، 30.8 µmol) استخدمت بروموتورس.
    3. نفذ الخطوات 2.1.1 ل 2.1.10 للحصول على متوسط 9، 5-أزيدوبينتيل-س-{[2,3,4,6-س-تيتراسيتيل-β-د-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-دياسيتيل-2-أسيتاميدو-2-ديوكسي-β-د-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-ترياسيتيل-α-د-مانوبيرانوسيل]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as رغوة بيضاء.
  4. Deprotection العالمي ل intermidiate
    1. تزن المركبة 9 (ز 0.010، 2.9 µmol) في قارورة مستديرة القاع واحد-رقبته 25 مل وإضافة شريط إثارة مغناطيسية، كاب مع الغشاء المطاطي، وإرفاق بالون نيتروجين.
    2. نقل 2 مل 1, 4 dioxane: ح2س (4:1) إلى قارورة. إضافة هيدروكسيد الليثيوم (ليوه) (0.005 ز، 50% بالوزن) إلى قارورة. إثارة رد فعل الخليط في 90-100 سج عن ح 12 والسماح لتبرد في الرايت
    3. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني وجاف قارورة تحت الفراغ ح 1 وملئه بالنيتروجين وإزالته من فراغ المتشعبة وكاب مع الغشاء المطاطي.
    4. حقن 4 مل من بيريدين الجافة و 2 مل من أنهيدريد الخل في قارورة من خلال حاجز استخدام حقنه 10 مل في 0 سجيم يقلب الخليط رد فعل ح 12 في الرايت
    5. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني من 0-10 [مبر] ضغط فراغ في 50 سجيم
    6. حل النفط الخام المخلوط باستخدام 30 مل DCM واستخراج الحل مع المشبعة مائي ناكو3 (2 × 20 مل) في قمع سيباراتوري 50 مل.
    7. إعادة استخراج الطبقة المائية مع DCM (3 × 15 مل). تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني.
    8. تحميل حل للمنتج في حوالي 2 مل DCM على رأس السرير والسليكا C18. الوت العمود باستخدام خليط من الماء والميثانول (0-100% ميثانول في الماء) وجمع كسور من 5-10 مل.
    9. جمع الكسور المنتج وتتبخر تحت الحد من الضغط للحصول على المنتج المطلوب رغوة بيضاء.
    10. حل المنتج إلى 5 مل ميثانول الجاف في 25 مل جولة قارورة السفلي وكاب مع الغشاء المطاطي.
    11. نقل 0.1 مل ميثوكسيد الصوديوم (ناومي) في الميثانول وباردة إلى 0 سج استخدام حمام الثلج ويقلب الخليط ح 12.
    12. إزالة المذيب استخدام مبخر دوراني والجاف للمنتج تحت التفريغ العالي.
    13. حل منتجات النفط الخام في 5 مل ميثانول: H2o: حمض الخليك (6:3:1).
    14. إضافة هيدروكسيد البلاديوم (Pd(OH)2) (50% بالوزن) وآثاره رد فعل تحت الغلاف الجوي الهيدروجين باستخدام بالون هيدروجين ح 15.
    15. تصفية رد فعل من خلال سرير سليت وتغسل مع الميثانول 2 مل تليها 2 مل الماء dd.
    16. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني.
    17. حل الخليط الخام بحوالي 1 مل من الماء وتحميله على رأس السرير جل polyacrylamide (انظر الجدول للمواد). الوت المنتج مع الماء وجمع الكسور 1-2 مل.
    18. رصد الكسور التي تم جمعها قبل TLC، ووضع مع n-butanol: H2o: حمض الخليك (1:1:1).
    19. جمع الكسور المنتج وليوفيليزي للحصول المنتج المطلوب 10، (5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)- α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a مسحوق أبيض.
    20. تميز المنتج بالرنين المغناطيسي والتحليل الطيفي الجماعي (انظر ملف البيانات التكميلية).

3-إعداد جليكانس مع ذيل حمض الفوسفونيك19،22

  1. تزن جليكان كل منهما (µmol 2-5) في قارورة أسفل المائدة مستديرة 5 مل وإضافة شريط إثارة مغناطيسية، وكاب مع الغشاء المطاطي.
  2. نقل 400 ميليلتر من ديميثيلفورماميدي الطازج المجفف.
  3. إضافة [2 (2 (2 (مكررا (بينزيلوكسي) فوسفوريل) اثوكسييثوكسي) كربونات الإيثيل (2، 5-dioxopyrrolidin1-يل)] (µmol 10-25، أعدت في البيت) لحل جليكان. يقلب الخليط 800 لفة في الدقيقة ح 5.
  4. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 5-10 [مبر] ضغط فراغ في 40 سجيم
  5. حل الخليط رد فعل في 0.5 مل مياه وتحميل في الجزء العلوي من السرير جل polyacrylamide (انظر الجدول للمواد). الوت المنتج باستخدام المياه وجمع الكسور 1-2 مل.
  6. مراقبة الكسور التي تم جمعها عن طريق TLC26. بقعة الخليط رد فعل على صفيحة TLC، وإضافة حل وصمة عار من موليبدات أمونيوم سيريوم 0.25 م؛ اتبع بالتدفئة باستخدام لوحة الساخن. جمع المنتجات المحتوية على الكسور وليوفيليزي للحصول على المنتج المطلوب كمسحوق أبيض.
  7. حل المنتج في 2 مل الماء، وإضافة Pd (OH)2 (50% بالوزن). إثارة رد فعل 800 لفة في الدقيقة تحت الغلاف الجوي الهيدروجين باستخدام بالون هيدروجين ح 15.
  8. تصفية رد فعل من خلال سرير أنود التمويه وتغسل مع الميثانول 2 مل تليها 2 مل ماء المقطر الشطب المتأين. تتبخر المذيبات استخدام مبخر دوراني في 300 [مبر] ضغط فراغ في 40 سجيم
  9. حل الخليط الخام بحوالي 1 مل من الماء وتحميله على رأس السرير جل polyacrylamide (انظر الجدول للمواد).
  10. الوت المنتج مع الماء وجمع الكسور 1-2 مل. مراقبة الكسور التي تم جمعها عن طريق TLC26. ليوفيليزي الكسور (تجميد المنتج باستخدام النتروجين السائل ثم ضعه في ليوفيليزير تحت فراغ) للحصول على المنتج المطلوب كمسحوق أبيض. تتميز المنتجات بواسطة الرنين المغناطيسي والتحليل الطيفي الجماعي (انظر ملف البيانات التكميلية) باستخدام د2س كمذيب.

4-جليكان الصفيف

  1. إعداد ألومنيوم المطلي الشرائح الزجاجية (ACG الشريحة) 19 , 20 , 22
    ملاحظة: تم تصنيع الشرائح الزجاجية المغلفة بالألومنيوم في شعبة تكنولوجيا الفيلم رقيقة، ومركز أبحاث التكنولوجيا أداة وتطبيق بحوث المختبرات الوطنية، حديقة العلوم هسينشو، تايوان.
    1. حزمة الشرائح المغلفة، وختم الفراغ منها لمنع تشكيل الحسابية، وتبقى مغلقة حتى رد فعل الكهروكيميائية للسطح أنوديزيشن.
  2. أنوديزيشن سطح من الألومنيوم المطلي الشرائح الزجاجية 19 , 20 , 22
    1. تعيين حاضنة درجة الحرارة التي تسيطر على 4 درجة مئوية. إعداد 0.3 M حمض الأكساليك محلول مائي ويبقيه في حمام الثلج. تأخذ كوب 500 مل، إضافة شريط محرض مغناطيسية.
    2. نقل حمض الأكساليك 0.3 M للكأس 500 مل، وثم وضع قضيب طويل البلاتين 10 سم كاثود في الحل. الحفاظ على إثارة (في 300 لفة في الدقيقة) حمض الأكساليك طوال عملية أنوديزيشن.
    3. قم بتشغيل مختبر برمجيات التتبع، انقر فوق الزر "إعداد" ثم "يعمل خيار اكتساح الجهد." تعيين البدء وإيقاف الجهد إلى 25.8 الخامس، عدد من النقاط إلى 100، الامتثال إلى 1، واكتساح التأخير لمرض التصلب العصبي المتعدد 1,200 وانقر فوق "موافق".
    4. المشبك الجانب الزجاج المغلفة بالألومنيوم التي تواجه نحو الكاثود. انقر فوق الزر "تشغيل اختبار". مراقبة القياس الحالي (mA ~ 8-10).
    5. بعد أنوديزيشن السطحية، غسل الشريحة جيدا بالماء المقطر مزدوجة وتطهير الجافة مع غاز النيتروجين وتخزينها ثم في دائرة رطوبة النسبية 30% حتى استخدامها مرة أخرى.
  3. تصنيع ACG جليكان ميكرواري 22
    1. إعداد 100 ميليلتر من جميع جليكانس الفموي الأحادي التكافؤ (I-حادي عشر) في الإثيلين غليكول 10 ملم تركيز منفردة.
    2. تمييع جليكان أعلاه مع المخزن المؤقت للطباعة (80% جليكول و 20% الماء المتأين دي) لجعل 100 ميكرومتر تركيز.
    3. ليجند المتغايرة الدراسة، إعداد 5 ميليلتر من جليكانس الفردية وأنا إلى الحادي عشر، وإلى كل إضافة 5 ميليلتر من الرجل5جلكناك2 (نسبة 1:1).
    4. [ميكروارس] الطباعة قبل الروبوتية دبوس (انظر الجدول للمواد) بترسب 0.6 nL جليكانس المجهز سابقا على ACG الشرائح31.
    5. تخزين الشرائح المطبوعة في مربع جافة رطوبة تسيطر قبل الفحص ملزمة.
  4. تعيين [ابيتوبس] جليكان من فيروس نقص المناعة البشرية-1 على نطاق واسع من تحييد الأجسام المضادة PG9 22
    1. إعداد 1 مل جيش صرب البوسنة الواردة ببست المخزن المؤقت، 3% w/v.
    2. إعداد ميليلتر 70 من PG9 (50 ميكروغرام/مل) في المخزن المؤقت ببست (جيش صرب البوسنة الواردة ببست المخزن المؤقت، 3% w/v).
    3. إعداد ميليلتر 120 من جسم علامة نيون الثانوية حمار الإنسان المضادة "مفتش" (أليكسا فلور 647 مترافق) 50 ميكروغرام/مل في ببست المخزن المؤقت (جيش صرب البوسنة الواردة ببست المخزن المؤقت، 3% w/v) في الظلام.
    4. مزيج جسم الأولية (PG9) وجسم علامة نيون الثانوي بنسبة 1:1 (60 ميليلتر في كل). احتضان خلط الأجسام المضادة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
    5. تحميل الشريحة ACG إلى غرفة الحضانة الشريحة التي تنقسم إلى 16 بئرا. نقل 100 ميليلتر من خلط الأجسام المضادة إلى الصفيف جليكان واحتضان في 4 درجات مئوية عن ح 16.
    6. بيبيت من خلط الأجسام المضادة. إزالة غرفة الحضانة الشريحة.
    7. تغسل الشريحة الأولى في ببست المخزن المؤقت (PBS و 0.05% توين-20)، متبوعاً بالماء المتأين الشطب وتدور الجافة في 2,000 س ز.
    8. فتح برنامج تحليل الصورة ميكرواري (انظر الجدول للمواد). قم بإدراج شريحة مع ميزات أراييد إلى الأسفل.
    9. انقر فوق القائمة "إعدادات"، وتعيين دقة الصورة إلى 5 ميكرومتر كل بكسل، والطول الموجي في 635 نانومتر مع PMT450 والطاقة إلى 100%.
    10. انقر فوق الزر "مسح" لبدء التصوير في الشريحة.
    11. انقر فوق رمز "ملف" لحفظ الصورة مسح تنسيق tif.
    12. إجراء تحليل للصورة باتباع دليل المستخدم البرنامج32.
    13. حساب مجموع شدة الأسفار وتوضيح استخدام البرمجيات33 ومعالجة الصور (انظر الجدول للمواد).
      ملاحظة: هنا، يعرض خطأ متوسط النسبة المئوية لكافة نقاط البيانات حسب مجالات الخطأ.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ويرد في الشكل 1استراتيجية العلاج الكيماوي الانزيمية وحدات لتركيب مجموعة واسعة من N-جليكانس. الاستراتيجية تستند إلى حقيقة أن التنوع يمكن أن تنشأ في بداية بتوليف الكيماوي الانزيمية الوحدات الهامة الثلاث، تليها مانوسيليشن α-محددة في 3-س 6 و/أوO موقف بقايا يطلق المشتركة تريساكتشاريدي الأساسية من N-جليكانس. وبالنظر إلى تنوع الهيكلية ثنائي-ثلاثي وهياكل-جليكان نوع معقد تترا أنتيناري ن، اعتقدنا أن استخدام مجموعة من المانحين أوليجوساكتشاريل ويقبلون تريساكتشاريديس الأساسية مع هاندليكولد الألكيل المثبتة مسبقاً كبداية مواد لتوليد التنوع الهيكلي المطلوب (الشكل 1). ثبت انطباق glycosyl فلوريد المانحين في بناء مكتبة جليكان معقدة سابقا21.

لإثبات فعالية استراتيجيتنا، اختير بنية متجازئه ثنائي أنتيناري (10، الرقم 3) للتوليف. D1 الذراع هوائيات 4 و D2 الذراع هوائيات 5 جليكان 10 تم إنشاؤها في جداول كبيرة بأساليب العلاج الكيماوي الانزيمية. على وجه الخصوص، يقبلون ديساكهارايد 1 كان انزيماتيكالي جالاكتوسيلاتيد باستخدام β-1 و 4-جالاكتوسيلترانسفيراسي واردين 5 '--ديفوسفوجالاكتوسي (UDP غال) لتشكيل تريساكتشاريدي 2. وكان متوسطة 2 التالي، فوكوسيلاتيد في موضع جلكناك 3-O في الوجود α-1, 3-فوكوسيلترانسفيراسي من الملوية البوابية (Hpα1، 3 متر) تحمل تيتراساكتشاريدي المطلوب 3. لربط المواد الكيميائية الأساسية، لبنات 2 و 3 بيراسيتيلاتيد الأولى، وتمت إزالة الحد نهاية فميثوكس مجموعة الفينول. وأخيراً، تم تركيب فلوريد حضور دست للحصول على الوحدات النمطية المطلوبة 4 و 5، على التوالي (الشكل 2).

وجود الوحدات المطلوبة في متناول اليد، نشرع التالية في جليكوسيلاتيونس تراكما أحيائياً فراغي النوعية 3- 4 تريساكتشاريدي كور 6 ظل الحفز تريفلات الفضة وكلوريد هافنوسيني لتوفير هيكساساكتشاريدي كل 7 (الشكل 3). حماية بينزيليديني أن إخفاء 4, 6-أوه تمت إزالتها باستخدام حفاز فحمض السلفونيك التولوين (فحساب السياحة الفرعي). الاستفادة من مفاعليه، الابتدائي 6-يا من 8 كان تجاوب مع فلوريد الوحدة 5 تحت ظروف تجريبية مماثلة لتحقيق ديكاساكتشاريدي المطلوب 9. في الماضي، أجرى deprotection العالمية للحصول على جليكان 10، التي تميزت كذلك باستخدام الرنين المغناطيسي والتحليل الطيفي الجماعي (انظر ملف البيانات التكميلية).

جليكانس التي تحتوي على ذيل أمين بينتيل في نهاية الحد تم تعديل مع linkers حمض الفوسفونيك وتعلق على سطح ACG عن طريق الكيمياء فوسفونات (الشكل 4). في بناب الماضي، وفيروس نقص المناعة البشرية-1 تم فحص PG9 لخصوصيته جليكان استخدام صفائف جليكانس هومو والمتغايرة لإثبات للمرة الأولى التي PG9 وتتفاعل مع هيتيروجليكانس المجاورة في حلقة V1/V2 من فيروس نقص المناعة البشرية-1 gp120 السطح (الشكل 5).

Figure 1
الشكل 1: وحدات استراتيجية عامة لإعداد N-جليكانس- (أ) يقدر عدد N-جليكانس التي تم إنشاؤها بواسطة هذه الاستراتيجية التي تحدث عادة في جليكوبروتينس البشرية تتجاوز 20,000. (ب) ثلاثة أنواع من الوحدات النمطية التي أعدها هذا النهج الكيماوي الانزيمية التي يمكن استخدامها في جليكوسيليشنز α-سيليتيفي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: تشيمونزيماتيك تجميع الوحدات النمطية. i, UDP-اللبن، بيتا 1، 4-جالت، ح 15، 86 في المائة؛ ثانيا، الناتج المحلي الإجمالي-فوكس، α 1، 3-فكة، ح 15، 84%؛ ثالثا، والتيار المتردد (1)2س، بيريدين، الرايت، ح 12؛ (1) يمكن أن تزاول: التولوين: ح2س، (3) دست، CH2Cl2-30 س"يمكن جيم": نترات أمونيوم سيريوم؛ دست: ديثيلامينوسولفور فلوريد ثلاثي.
مسميات المنتج: 1 فجلوكوبيرانوسيل-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D--(1→ 2)-α-د-مانوبيرانوسيدي؛ 2، p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside؛ 3، فس-β-د-جالاكتوبيرانوسيل-(1→4)-[α-L-فوكوبيرانوسيل-(1→3)-2-أسيتاميدو-2-ديوكسي-β-د-glucopyranosyl]-(1→2)-α-د-مانوبيرانوسيدي-ميثوكسيفينيل؛ 4[فلوريد diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl 2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-؛ 5، [فلوريد fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl 2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L- انقر هنا للاطلاع نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: جليكوسيليشن الكيميائية D1/D2 الذراع الوحدات الأساسية يقبلون. وأنا، 4، أجوتف، Cp2هفكل2، والتولوين، 4 Å مرض التصلب العصبي المتعدد، 0 سج على RT، 70 في المائة؛ ثانيا، فحساب السياحة الفرعي، الاسيتو الانيتريل، الرايت، 57%؛ ثالثا، 5، أجوتف، Cp2هفكل2، والتولوين، 4 Å مرض التصلب العصبي المتعدد، 0 سج على RT، 34 في المائة؛ رابعا، (1) ليوه، 1، 4-ديوكساني: ح2س؛ ج 90 س، ح 12؛ (2) ميلان2س، بيريدين، ح 12؛ (3) ناومي، ميوه، ح 12؛ (4) Pd(OH)2، ميوه: ح2س: هكووه (5:3:2)، ح2، 36%. أجوتف: تريفلوروميثانيسولفوناتي الفضة؛ Cp2هفكل2: كلوريد الهافنيوم مكررا (سيكلوبينتادينيل)، مرض التصلب العصبي المتعدد: ثقب سيتا الجزيئية، مسميات المنتج: 7، 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8، 5-أزيدوبينتيل-س-(2-يا-أسيتيل-3,4,6-ثلاثي--يا-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- 9، O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10، 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: تجميد جليكان في صفيف ACG. (أ) تعديل المواد الكيميائية جليكان مع ذيل الأمينية إلى حمض الفوسفونيك الذيل لمرفق التساهمية إلى الشريحة ACG عن طريق الكيمياء فوسفونات. (ب) توزيع جليكانس على سطح ACG. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: تحليل صفيف جلين. (أ) الهياكل من N-جليكانس الاصطناعية التي يتم طباعتها على صفيف ACG. (ب) ربط تحليل PG9 جليكانس الفردية أنا الحادي عشر المطبوعة على صفيف ACG (اللوحة اليمنى) وخلائط جليكان من الرجل5 مختلطة مع جليكانس أنا إلى الحادي عشر (اللوحة اليمنى) مع 100 ميكرومتر تركيز. وترد تركيزات المولى في ميكرومتر ل PG9 في وسيلة الإيضاح. وترد إشارة متوسط كثافة والخطأ القياسي المحسوبة لخمسة replicates المستقلة في الصفيف. إظهار insets الصور الفلورية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

فئة من بنابس فيروس نقص المناعة البشرية-1 بما في ذلك PG9، PG16، و 128 بجتس، 141-145 أفيد بأن تكون قوية للغاية في تحييد 70-80% من تعميم يعزل فيروس نقص المناعة البشرية-1. [ابيتوبس] من هذه بنابس هي المحافظة عاليا بين متغيرات المجموعة بأكملها فيروس نقص المناعة البشرية-1 م، ذلك أنها قد دليل تصميم إيمونوجين فعالية لقاح لفيروس نقص المناعة البشرية للحصول على تحييد الأجسام المضادة23،24،25 . كجزء من جهودنا المستمرة للتعرف جليكان [ابيتوبس] على نطاق واسع تحييد الأجسام المضادة لفيروس نقص المناعة البشرية-1، أبلغنا التوليف الكيميائية والانزيميه فريق يطلق عالية، والهجين، و oligosaccharides النوع المعقد لتشكيل مجموعة جليكان21، 22. الصفائف جليكان شائعة الاستخدام في الشرائح الزجاجية (NHS) المغلفة-هيدروكسيسوكسينيميدي نغير قادر على الكشف عن تفاعلات البروتين الكربوهيدرات منخفضة تقارب، ربما بسبب التوزيع غير المتجانس جليكان الناتجة عن التحلل من رد الفعل N-هيدروكسيسوكسيميدي المجموعات الوظيفية على سطحه. للتغلب على القيود المفروضة على صيغ الصفيف التقليدية، قمنا بتطوير مجموعة جليكان على شريحة (ACG) زجاج مغلف أكسيد الألومنيوم. كذلك أجرينا مقارنة تجانس بين مجموعة ACG والمستشفيات العامة استخداماً صفيف لإثبات أن الصفيف ACG عرض تقديمي جليكان أكثر تجانساً على السطح في22. ولم يستطع تحليلنا الأولى الملزمة مراقبة ملزمة PG9 إلى أي من جليكانس في دائرة الصحة الوطنية الصفيف (البيانات لا تظهر). ولذلك، لتعريف خصوصية ملزم PG9، جليكانس أنا-الحادي عشر في تعلق على ذيل حمض الفوسفونيك والمطبوع على الشريحة ACG مع 100 ميكرون من جليكانس الفردية (الشكل 4). تقدم التثبيت جليكان على شريحة ACG عن طريق الكيمياء فوسفونات توزيعاً أكثر استقرارا وأكثر تجانساً. كل من جليكانس تمت طباعته مع خمسة replicates وتم الحصول على الصور الشريحة من مسح الأسفار بعد حمار مترافق DyLight649 الإنسان المضادة مفتش جسم الحضانة. تحليل ملزمة PG9 نحو الفردية جليكانس المطبوعة على صفيف ACG (الشكل 5، اللوحة اليمنى) يوحي بأن PG9 تفاعلت بشدة مع جليكان الهجين من نوع (X). كما تم الكشف عن التفاعلات ليطلق عالية نوع Man5 (جليكان الرابع) والنوع المعقد جليكان (الحادي عشر).

مستوى التفاعلات الجزيئية بين جليكان PG9 والهجين من نوع (X) صعوبة تحديد نظراً لعدم وجود معلومات هيكل الكريستال مشارك الخاصة بهم. جليكان الهجين من نوع X يتكون من ذراع النوع المعقد في ال 3-ترتبط بموقفيا القلب وذراع تريمانوسي 6-O موقف تريساكتشاريدي الوسطى. ملزمة PG9 إلى جليكان هجين X تشير إلى أن PG9 يتطلب بقايا يطلق والحامض اللعابي في الجوار لتفاعلات تقارب عالية. لتحديد تركيبة جليكان الذي يناسب إلى جيب ملزم PG9، أجرينا دراسة صفيف جليكان مختلطة. رابعا جليكان مختلطة مع كل جليكان من أنا-الحادي عشر بنسبة 1:1 الخلد ورصدت في صفيف ACG. تحليل PG9 ملزم لكل من الخلائط أشارت إلى أن مزيجاً من الرجل5 واللجنة الدائمة (الرابع + الحادي عشر) أسفرت عن تقارب أعلى نحو PG9 مقارنة بالرابع أو الحادي عشر وحدها. وباﻹضافة إلى ذلك، كشف المزائج المحتوية على رجل5 ، وتلك التي تحتوي على هوائيات سياليلاتيد مثل جليكانس الثامن والعاشر وكانت أيضا22. للمرة الأولى، عرضت هذه النتائج دليلاً صفيف على أساس لسلوك ربط هترو-جليكانس من PG9 التي اقترحت دراسات الهيكل البلوري من PG9 مع المجال V1/V2 gp120 فيروس نقص المناعة البشرية-123.

وفي الختام، لقد أظهرنا استراتيجية العلاج الكيماوي الانزيمية وحدات فعالة للتحضير ل درجة عالية من التنوع N-ترتبط oligosaccharides التي تحدث في جليكوبروتينس البشرية. وبالإضافة إلى ذلك، وضع صفيف ACG يوفر وسيلة فعالة لتحديد تفاعلات البروتين-الكربوهيدرات ضعيفة للغاية، والأهم من ذلك، أن التفاعلات التي تحدث عن طريق هترو-جليكانس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

يشكر المؤلفون رقيقة شعبة تكنولوجيا السينما ومركز بحوث التكنولوجيا أداة (إيترك) وتطبيق بحوث المختبرات الوطنية، حديقة العلوم هسينشو، تايوان. هذا العمل كان يدعمه "المجلس الوطني للعلوم" (منحة لا. معظم الوثيقة 105-0210-01-13-01) وسينيكا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, P. J., Lee, D. Y., Jeong, H. Centralized modularity of N-linked glycosylation pathways in mammalian cells. PloS one. 4, e7317 (2009).
  2. Townsley, S., Li, Y., Kozyrev, Y., Cleveland, B., Hu, S. L. Conserved Role of an N-Linked Glycan on the Surface Antigen of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Modulating Virus Sensitivity to Broadly Neutralizing Antibodies Against the Receptor and Coreceptor Binding Sites. J.virol. 90, 829-841 (2015).
  3. Wang, Z., et al. A General Strategy for the Chemoenzymatic Synthesis of Asymmetrically Branched N-Glycans. Science. 341, 379-383 (2013).
  4. Li, L., et al. Efficient Chemoenzymatic Synthesis of an N-glycan Isomer Library. Chem Sci. 6, 5652-5661 (2015).
  5. Pritchard, L. K., Harvey, D. J., Bonomelli, C., Crispin, M., Doores, K. J. Cell- and Protein-Directed Glycosylation of Native Cleaved HIV-1 Envelope. J.Virol. 89, 8932-8944 (2015).
  6. Behrens, A. J., et al. Composition and Antigenic Effects of Individual Glycan Sites of a Trimeric HIV-1 Envelope Glycoprotein. Cell Rep. 14, 2695-2706 (2016).
  7. Barouch, D. H. Challenges in the development of an HIV-1 vaccine. Nature. 455, 613-619 (2008).
  8. Horiya, S., MacPherson, I. S., Krauss, I. J. Recent Strategies Targeting HIV Glycans in Vaccine Design. Nat Chem Bio. 10, 990-999 (2014).
  9. Wang, L. X. Synthetic carbohydrate Antigens for HIV Vaccine Design. Curr Opin Chem Biol. 17, 997-1005 (2013).
  10. Tian, J., et al. Effect of Glycosylation on an Immunodominant Region in the V1V2 Variable Domain of the HIV-1 Envelope gp120 Protein. PLoS Comput Biol. 12, e1005094 (2016).
  11. Geyer, H., Holschbach, C., Hunsmann, G., Schneider, J. Carbohydrates of human Immunodeficiency Virus. Structures of Oligosaccharides Linked to the Envelope Glycoprotein 120. The J Bio Chem. 263, 11760-11767 (1988).
  12. Lee, J. H., Ozorowski, G., Ward, A. B. Cryo-EM Structure of A Native, Fully Glycosylated, Cleaved HIV-1 Envelope Trimer. Science. 351, 1043-1048 (2016).
  13. Lonardi, E., Balog, C. I., Deelder, A. M., Wuhrer, M. Natural GlycanMicroarrays. Expert Rev Proteomics. 7, 761-774 (2010).
  14. Paulson, J. C., Blixt, O., Collins, B. E. Sweet Spots in Functional Glycomics. Nat. Chem. Bio. 2, 238-248 (2006).
  15. Dotsey, E. Y., et al. A High Throughput Protein Microarray Approach to Classify HIV Monoclonal Antibodies and Variant Antigens. PLoS One. 10, e0125581 (2015).
  16. Wu, C. Y., Liang, P. H., Wong, C. H. New Development of Glycan Arrays. Org Biomol Chem. 7, 2247-2254 (2009).
  17. Scurr, D. J., et al. Surface Characterization of Carbohydrate Microarrays. Langmuir. 26, 17143-17155 (2010).
  18. Blixt, O., et al. Printed Covalent Glycan Array for Ligand Profiling of Diverse Glycan Binding Proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  19. Chang, S. H., et al. Glycan Array on Aluminum Oxide-Coated Glass Slides Through Phosphonate Chemistry. J. Am. Chem. Soc. 132, 13371-13380 (2010).
  20. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1, 773-783 (2016).
  21. Shivatare, S. S., et al. Efficient Convergent Synthesis of Bi-, Tri-, and Tetra-Antennary Complex Type N-Glycans and Their HIV-1 Antigenicity. J. Am. Chem. Soc. 135, 15382-15391 (2013).
  22. Shivatare, S. S., et al. Modular synthesis of N-Glycans and Arrays for the Hetero-Ligand Binding Analysis of HIV Antibodies. Nat Chem. 8, 338-346 (2016).
  23. McLellan, J. S., et al. Structure of Hiv-1 gp120 V1/V2 Domain with Broadly Neutralizing Antibody PG9. Nature. 480, 336-343 (2011).
  24. Julien, J. P., et al. Asymmetric Recognition of the HIV-1 Trimer by Broadly Neutralizing Antibody PG9. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 4351-4356 (2013).
  25. Willis, J. R., et al. Long Antibody HCDR3s from HIV-Native Donors Presented on a PG9 Neutralizing Antibody Background Mediate HIV Neutralization. Proc Natl Acad Sci U S A. 113, 4446-4451 (2016).
  26. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Performing 1D Thin Layer Chromatography. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  27. de Castro, M. D., et al. A useful approach to the automation of analytical processes? J Automat Chem. 12, 267-279 (1990).
  28. JoVE Science Education Database. Essentials of Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  29. JoVE Science Education Database. Essentials of Analytical Chemistry. Introduction to Mass Spectrometry. JoVE. , Cambridge, MA. (2017).
  30. Tseng, S. Y., et al. Preparation of Aluminum Oxide-Coated Glass Slides for Glycan Microarrays. ACS Omega. 1 (5), 773-783 (2016).
  31. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 17033-17038 (2004).
  32. GenePix Pro 6.0 Microarray Acquisition and Analysis Software for GenePix Microarray Scanners User’s Guide & Tutorial. , Axon Instruments/ Molecular Devices Corp. Sunnyvale, CA. (2017).
  33. GraphPad Prism version 6.01 for Windows. GraphPad Software. , La Jolla California USA. Available from: http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ (2017).

Tags

الكيمياء، العدد 132، توليف الكيماوي الانزيمية، صفائف جليكان ACG، فيروس نقص المناعة البشرية تحييد الأجسام المضادة، N-جليكانس، خصوصية التنميط، نهج نموذجي
توليف الكيماوي الانزيمية من <em>N</em>-جليكانس للتنمية الصفيف وأضداد الفيروس التنميط
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S.,… More

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter