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Chemistry

Chemo-enzymatische Synthese von N- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling

Published: February 5, 2018 doi: 10.3791/55855
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Genomics Research Center, Academia Sinica

Summary

Ein modularer Ansatz für die Synthese von N- Glykanen zur Befestigung an einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas schieben (ACG Folie) wie ein Glycan Microarray entwickelt wurde und seine Verwendung für die Profilerstellung für eine HIV weitgehend neutralisierende Antikörper nachgewiesen.

Abstract

Wir präsentieren Ihnen eine hocheffiziente Weise für die schnelle Zubereitung einer breiten Palette von N-verknüpft Oligosaccharide (schätzungsweise um 20.000 Strukturen zu überschreiten), die auf menschlichen Glykoproteinen weit verbreitet sind. Um die gewünschte strukturelle Vielfalt zu erreichen, begann die Strategie mit der Chemo-enzymatische Synthese der drei Arten von Oligosaccharyl Fluorid Module, gefolgt von ihrer schrittweisen α-selektive Glykosylierungen an der 3-O und 6-O der Positionen der Mannose-Reste von den gemeinsamen Kern Trisaccharide haben eine entscheidende β-Mannoside-Verbindung. Anbei zeigen wir weitere N- Glykane auf die Oberfläche einer Aluminiumoxid-beschichtete Glas (ACG) Folie erstellen Sie eine kovalente gemischte Anordnung für die Analyse von Hetero-Ligand Interaktion mit einem HIV-Antikörper. Geben Sie insbesondere das Bindungsverhalten von ein neu isolierte HIV-1 im großen und ganzen neutralisierende Antikörper (bNAb), PG9, zur Mischung von eng beieinander liegenden Mann5GlcNAc2 (Mensch5) und 2,6-di-Sialylated Bi-antennary N- Glycan (SCT ) auf eine ACG-Array, öffnet sich einen neuen Weg um das effektive Immunogen Design für HIV-Impfstoff-Entwicklung führen. Darüber hinaus verkörpert unsere ACG-Array ein mächtiges Werkzeug um andere HIV-Antikörper für Hetero-Liganden Bindungsverhalten zu studieren.

Introduction

N- Glykane auf Glykoproteine sind kovalent das Asparagin verbunden (Asn) Rückstände von den Konsens Asn-Xxx-Ser/Thr Sequon betreffen mehrere biologische Prozesse wie Protein-Konformation, Antigenität, Löslichkeit und Lektin-Anerkennung 1 , 2. die chemische Synthese von N-verknüpften Oligosacchariden repräsentiert eine synthetische Herausforderung wegen ihrer großen strukturellen Mikro Heterogenität und stark verzweigte Architektur. Sorgfältige Auswahl des Schutzes Gruppen Tune Reaktivität der Bausteine, Selektivität in Anomeric Zentren und ordnungsgemäße Verwendung der Projektträger zu erreichen / Activator(s) sind Schlüsselelemente in der Synthese von komplexen Oligosaccharide. Um diese Komplexität zu lösen, wurde eine große Menge an Arbeit, N- Glycan Synthese voraus berichtet vor kurzem3,4. Trotz dieser robusten Ansätze finden eine effektive Methode für die Herstellung einer breiten Palette von N- Glykanen (~ 20.000) bleibt eine große Herausforderung.

Die schnellen Mutationsrate von HIV-1, die umfangreiche genetische Vielfalt und seine Fähigkeit zur Flucht aus neutralisierende Antikörper-Reaktion, zu erreichen ist eine der größten Herausforderungen zu entwickeln, einen sicheren und prophylaktischen Impfstoff gegen HIV-1-5,6 , 7. eine wirksame Taktik, die HIV verwendet, um die Host-Immunantwort zu vermeiden ist die post-translationalen Glykosylierung der Umschlag Glykoprotein gp120 mit einem vielfältigen N-Glykane abgeleitet vom Host Glykosylierung Maschinen8, verbunden 9. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht über die genaue Analyse von rekombinanten Monomeren HIV-1 gp120 Glykosylierung von menschlichen embryonalen (HEK) 293T Nierenzellen schlägt das Auftreten von strukturellen Microheterogeneity mit einer charakteristischen zellspezifische Muster10 , 11 , 12. daher die Glycan Besonderheiten der HIV-1-bNAbs erfordert gut charakterisierten gp120 Verständnis im Zusammenhang mit N- Glycan Strukturen in einer Menge, die ausreicht für die Analyse.

Die Entdeckung von Glycan-Microarray-Technologie zur Verfügung gestellt hohe Durchsatz-basierte Exploration Besonderheiten der unterschiedlichsten Kohlenhydrat-bindende Proteine, Viren/Bakterien Adhesins, Giftstoffe, Antikörper und Lectines13,14 . Die systematische Glykane Anordnung in einem angeordneten Chip-basierten Format könnte problematisch geringe Affinität Protein-Glycan Interaktionen durch multivalente Präsentation15,16,17,18bestimmen. Diese Chip-basierte Glycan Anordnung scheint bequem effektiv Zell-Zell-Schnittstellen zu imitieren. Um die Technologie zu bereichern und überwinden die ungleichmäßige Problem mit herkömmlichen Array Formate, entwickelt unsere Gruppe vor kurzem eine Glycan-Array auf eine Aluminiumoxid-beschichtete Glas (ACG) Folie mit phosphonic Acid-ended Glykoproteinen, um die Signalstärke zu verbessern, Homogenität und Empfindlichkeit19,20.

Um den Stand der Erkenntnisse über Glycan Epitope neu isolierte HIV-1 breit neutralisierenden Antikörpern (bNAbs) zu verbessern, haben wir eine hocheffiziente modulare Strategie für die Herstellung einer breiten Palette von N-Glykanen21 verbunden ,22 Drucken auf eine ACG schieben (siehe Abbildung 1). Spezifität Profile Studien von HIV-1-bNAbs auf eine ACG-Reihe angeboten, dass die ungewöhnliche Erkennung von Hetero-Glycan Bindungsverhalten von hochpotenten bNAb PG9, die von HIV isoliert wurde Personen23,24,25infiziert.

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Protocol

1. Vorbereitung des D1/D2 Arm Module22

  1. Vorbereitung der Mittelstufe 2
    1. Wiegen, Werkstoff- 1 (siehe Abbildung 2, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (100 mg, 0.204 Mmol)) in einem 15 mL Tube ab und lösen sich in Tris Puffer (25 mM, pH 7,5) mit Mangan Paraquatdichlorid (MnCl2, 10 mM), um eine endgültige Glycan-Konzentration von 5 mM zu erreichen.
    2. Fügen Sie 2 Äquivalente von Uridin-diphosphat-Galaktose (UDP-Gal).
    3. 150 Einheiten des Enzyms β-1, 4 Galactosyl Transferasen aus bovine Milch hinzufügen und die Mischung bei 37 oC für 15 h inkubieren.
    4. Nach 15 h, führen Dünnschichtchromatographie (TLC) Gesamtverbrauch des Ausgangsmaterials durch spotting das Reaktionsgemisch auf einer TLC Platte an, entwickeln mit n-Butanol/Essigsäure Säure/Wasser (H2O) mit einem 1:1:1 Verhältnis und Fleckenbildung durch eine Lösung von 0,25 M Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung. Dann die Reaktion durch Erhitzen auf 90 oC für 5 min zu stillen.
    5. Das Reaktionsgemisch mit einer Geschwindigkeit von 2.737 x g für 3 min Zentrifugieren, und laden Sie den Überstand an der Spitze der Säule Polyacrylamid-Gel (siehe Tabelle der Materialien). Eluieren der Spalte, die Verwendung von destilliertem deionisiertes Wassers, und sammeln Sie das Produkt mit Bruchteilen von 1-2 mL.
    6. Überwachen der gesammelten Fraktionen von TLC26, entwickeln mit n-Butanol: H2o: Essigsäure mit einem 1:1:1 Verhältnis und Fleckenbildung durch eine Lösung von Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung. Lyophilize27 das Produkt mit Fraktionen zu Mittelstufe 2 (115 mg, 86 %) als weißes Pulver. Das Produkt durch NMR28 und Massenspektroskopie29 (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  2. Vorbereitung der Mittelstufe 3
    1. Wiegen ab Material 2 (siehe Abbildung 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (80 mg, 0,122 Mmol)) in einem 15 mL-Tube und in Tris auflösen Puffer (25 mM, pH 7,5) enthaltenden MnCl2 (10 mM) zur Vorbereitung einer endgültigen Glycan-Konzentration von 5 mM.
    2. Fügen Sie 2 Äquivalente Guanosin-5'-Diphospho-β-L-Fucose Binatrium-Salz (BIP-Fuc).
    3. Hinzufügen von 150 Einheiten des Enzyms α-1, 3 Fucosyl Transferasen von Helicobacter Pylori (Hp1-3FTΔ26695) und inkubieren Sie die Mischung bei 37 oC für 15 h.
    4. Folgen Sie den Schritten 1.1.4.
    5. Folgen Sie den Schritten 1.1.5.
    6. Folgen Sie Schritt 1.1.6 Mittelstufe 3 (82 mg, 84 %) erhalten als weißes Pulver. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  3. Vorbereitung der Module 4 und 5
    1. Wiegen Sie zusammengesetzte 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,230 g, 0.360 Mmol) oder zusammengesetzte 3, p- Methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside (0,100 g, 0,125 Mmol) in ein 25 mL Einzel-Hals Rundboden Kolben und unter Vakuum für 30 min trocknen.
    2. Entfernen Sie die Flasche aus Vakuum, füllen Sie ihn mit Stickstoffgas hinzufügen eine magnetische Stir Bar, cap es mit einem Gummiseptum und legen einen Stickstoff-Ballon.
    3. Injizieren Sie 7 mL trockenem Pyridin und 3 mL Essigsäureanhydrid (Ac2O) in die Küvette in einem Eisbad auf 0 oC. Rühren die daraus resultierende Reaktion für 12 h bei Raumtemperatur mit einem Magnetrührer bei 600-700 u/min gebracht. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Rotary Verdampfer mit einem Vakuum Druck von 0 - 10 Mbar bei 50 oC.
    4. Verdünnen Sie die krude Mischung mit 30 mL Dichlormethan (DCM) und extrahieren mit gesättigten wässrigen Natrium-Hydrogencarbonat (Nahco33) (2 x 20 mL) in ein 50 mL separatory Trichter.
    5. Extrahieren Sie erneut die wässrige Schicht mit DCM (3 x 15 mL) und die kombinierten organischen Schichten über Natriumsulfat getrocknet. Das Natriumsulfat durch Filtration entfernen und waschen mit DCM (5 mL). Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 400 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    6. Laden Sie die Projektmappe krude Mischung in 2 mL von DCM auf dem Silizium-Bett.
    7. Eluieren Sie die Spalte mit ein Gemisch mit Toluol und Aceton von 0 - 20 % Aceton in Toluol und sammeln Sie Bruchteile von 5-10 mL.
    8. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC (Schritte 1.1.4 und 1.1.6), entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3), und mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat Färbung durch Erhitzen auf einer heißen Platte gefolgt.
    9. Verdunsten Sie das Produkt mit Fraktionen mit einem Drehverdampfer, um gewünschte Produkte wie weißer Schaum in 72 % und 85 % Ertrag, bzw. zu erhalten.
    10. Die Produkte in 7 mL Acetonitril auflösen: Toluol: H2O in einem 4:2:1 Verhältnis in ein 25 mL Rundboden Kolben.
    11. Fügen Sie beim Abkühlen auf 0 oC mit einem Eisbad Cerium Ammoniumnitrat (2 Äquivalente hinzu). Rühren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für 3 h bei ~ 500-800 u/min.
    12. Nach TLC Gesamtverbrauch des Ausgangsmaterials angibt (TLC entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3) und Visualisierung von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), verdünnen das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat (30 mL) und Extrakt mit H2O (15 x 2 mL).
    13. Extrahieren Sie die kombinierten organischen Schichten mit 5 mL der gesättigten Natriumchlorid (NaCl)-Lösung.
    14. Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 240 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    15. Laden Sie die Projektmappe Rohprodukt in 2 mL von DCM auf dem Silizium-Bett. Eluieren Sie die Spalte mit ein Gemisch mit Toluol und Aceton (0 - 20 % Aceton in Toluol) und sammeln Sie Bruchteile von 5-10 mL. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3).
    16. Verdunsten Sie die Produkt-haltige Fraktionen mit einen Drehverdampfer auf 77 Mbar Unterdruck und 40 oC, gewünschte Produkte als weißer Schaum zu bekommen.
    17. Lösen sich die entsprechenden Alkohole in 10 mL von DCM in einer 25 mL Einzel-Hals Rundboden Kolben und kühl bis-30 oC.
    18. Fügen Sie Diethylaminosulfur Trifluoride (DAST, 2 Äquivalente). Rühren Sie die Reaktionsmischung bei-30 oC 2 h.
    19. Nach TLC Verbrauch zeigt des Ausgangsmaterials (TLC entwickeln mit Toluol/Aceton (4/1) und Visualisierung von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), verdünnen Sie das Reaktionsgemisch mit DCM (30 mL) , und waschen mit gesättigten Nahco33 (15 x 2 mL).
    20. Extrahieren der kombinierten organischen Schicht mit 5 mL gesättigte NaCl-Lösung, trocknen Sie es durch Hinzufügen von wasserfreiem Magnesiumsulfat, Filtern Sie das Gemisch nach Waschen mit DCM (5 mL) und sammeln es in einem 100 mL Einzel-Hals Rundboden Kolben.
    21. Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 400 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    22. Laden Sie die Projektmappe Rohprodukt in 2 mL DCM auf dem Silizium-Bett. Eluieren Sie die Spalte mit einer Mischung aus Toluol und Aceton (0-20 % Aceton in Toluol) und sammle Bruchteile von 5-10 mL.
    23. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit Toluol/Aceton (7/3).
    24. Verdampfen Sie das Produkt mit Fraktionen mit einem Drehverdampfer um Wunschprodukte 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6- O-Triacetyl-α-D-Mannopyranosyl Fluorid (54 % über 2 Stufen) und 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)- 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl Fluorid (67 % über 2 Stufen) als weißer Feststoff.
    25. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.

2. Vorbereitung des Glycan 10

  1. Vorbereitung der Intermidiate 7
    1. Silber triflate (AgOTf) (0,039 g, 0.155 Mmol), bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) Paraquatdichlorid (Cp2HfCl2) (0,041 g, 0,108 Mmol) in einen 25-mL Einzel-Hals Rundboden Kolben wiegen, im Schlenk Linie Vakuum für 30 min trocknen, entfernen Sie es aus der Vakuum, und füllen Sie ihn mit Stickstoffgas.
    2. Die frisch getrockneten 4 Å Molekularsiebe (0,2 g) in den Kolben mit der AgOTf und Cp2HfCl2zu übertragen, fügen Sie eine magnetische Stir Bar cap mit dem Septum sofort und Hinzufügen A Stickstoff Ballon.
    3. Übertragen Sie 3 mL trockener Toluol in den Kolben mit einem trockenen Glasspritze. Rühren Sie das Reaktionsgemisch für 1 h bei Raumtemperatur und dann abkühlen auf 0 oC.
    4. Injektion einer Lösung von Geber 4 (Abbildung 2, 0,043 g, 0.046 Mmol) und Akzeptor- 6, 5-Azidopentyl-O-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) Carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranoside (Abbildung 3, 0,045 g, 0.031 Mmol) in 3 mL Toluol in den Kolben durch das Septum mit einer 10 mL Spritze auf 0 o C. Rühren Sie die Reaktionsmischung bei Raumtemperatur für 3 h.
    5. Nach TLC Verbrauch zeigt der Ausgangsstoffe (TLC, mit DCM/Aceton (8,5/1.5) entwickeln und visualisieren von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), die Reaktion durch Injektion 10 zu stillen Äquivalente Triethyl Amin.
    6. Filtern Sie der Molekularsiebe durch eine Celite-Bett in einem 50 mL Runde Talsohle Kolben, und weiter mit 10 mL Ethylacetat waschen. Extrahieren Sie die kombinierten organischen Schichten mit einer gesättigten Lösung von wässrigen Nahco33 (2 x 20 mL) in einem 50 mL separatory Trichter. Die wässrige Schicht mit Ethylacetat (3 x 15 mL) zu extrahieren.
    7. Extrahieren Sie die kombinierten organischen Schichten mit gesättigte NaCl-Lösung (5 mL), trocknen Sie es mithilfe von wasserfreiem Magnesiumsulfat, Filtern Sie das Gemisch zum Entfernen der Magnesium-Sulfat, waschen mit Ethylacetat (3 x 15 mL) und das Filtrat in einem 100 mL Runde Talsohle Kolben zu sammeln.
    8. Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer am 240 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    9. Laden Sie die Projektmappe Rohprodukt in DCM oben auf der Silica-Bett-Spalte. Eluieren Sie die Spalte mit ein Gemisch mit DCM und Aceton (0-10 % Aceton in DCM) und sammeln Sie Bruchteile von 5-10 mL.
    10. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit DCM/Aceton (8,5/1.5). Verdunsten Sie die Fraktionen mit Produkt mit einem Drehverdampfer um zu erhalten Intermidiate 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[ 3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-( 2,2,2-Trichloroethoxy) Carbonylamino-β-D-Glucopyranoside (0,052 g, 70 %), als weißer Schaum.
    11. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  2. Vorbereitung der Intermidiate 8
    1. Hexasaccharide 7 (Abbildung 3, 0,040 g, 0,016 Mmol) in einen 25-mL Einzel-Hals Rundboden Kolben wiegen, unter Vakuum für 1 h trocknen Vakuum entfernen, füllen Sie ihn mit Stickstoffgas, fügen Sie eine magnetische Stir Bar und cap es mit einem Gummiseptum.
    2. Übertragen Sie 3 mL Acetonitrile:methanol (MeOH) (Verhältnis 2:1) in den Kolben.
    3. Fügen Sie p-Toluol Sulfonsäure-Monohydrat (0,001 g, 0,008 Mmol) in den Reaktionskolben und rühren die Reaktion bei 800 u/min für 5 h.
    4. Nach TLC Wasserbedarf des Ausgangsmaterials angibt (TLC, mit DCM/Aceton (8,5/1.5) entwickeln und visualisieren von UV-Absorption bei 254 nm oder durch Färbung mit einer Lösung aus Cerium Ammonium Molybdat gefolgt von Heizung), die Reaktion durch Injektion 10 zu stillen Äquivalente Triethyl Amin.
    5. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 337 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
    6. Lösen Sie die krude Mischung mit etwa 2 mL der DCM auf und laden Sie sie auf dem Bett Kieselsäure.
    7. Eluieren Sie die Spalte mit einer Mischung aus DCM und Aceton (0 - 10 % Aceton in DCM) und sammle Bruchteile von 5-10 mL. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC, entwickeln mit DCM/Aceton (8,5/1.5). Verdampfen des Lösungsmittels über einen Drehverdampfer an 400 Mbar Unterdruck und 40 oC.
    8. Trocknen Sie die Rückstände unter vermindertem Druck zu mittleren 8, 5-Azidopentyl-O-(2-O-acetyl-3,4,6-tri-O-benzyl-ced pressure to give →3)-2-O-Acetyl-4, 6-O-Benzylidine-β - D - Mannopyranosyl-(1→4) - O-(3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6 - di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-nzyl-2-deoxy-2-phth. (Abbildung 3, 0,022 g, 57 %) als ein weißer Feststoff. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.
  3. Vorbereitung der Intermidiate 9
    1. Vorbereitung der Intermidiate 9 (Abbildung 3) wurde mit Spender 5 (0,015 g, 13.2 µmol) und Akzeptor 8 (Abbildung 3, 0,020 g 8,80 µmol) erreicht.
    2. AgOTf (0,011 g, 44,1 µmol) und Cp2HfCl2 (0,012 g, 30,8 µmol) dienten als ein Promotoren.
    3. Führen Sie die Schritte 2.1.1 bis 2.1.10 zu zwischen- 9, 5-Azidopentyl - O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]} -(1→3)-{2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2- O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-D-glucopyra (0.010 g, 34%), as weißer Schaum.
  4. Globale Deprotection intermidiate
    1. Wiegen Sie zusammengesetzte 9 (0,010 g, 2,9 µmol) in einen 25-mL Einzel-Hals Rundboden Kolben, fügen Sie eine magnetische rühren Bar, Kappe mit einem Gummiseptum und legen Sie einen Stickstoff-Ballon.
    2. Transfer von 1, 2 mL 4 Dioxan: H2O (4:1) in den Kolben. Fügen Sie Lithiumhydroxid (LiOH) (0,005 g, 50 % von WT) in die Flasche. Rühren Sie die Reaktionsmischung bei 90-100 oC für 12 h und bei RT abkühlen lassen
    3. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer und Trocknen des Kolbens unter Vakuum für 1 h, füllen Sie ihn mit Stickstoff aus dem Vakuum Verteiler entfernen und mit einem Gummiseptum Kappe.
    4. Injizieren von 4 mL trockenem Pyridin und 2 mL Essigsäureanhydrid in den Kolben durch das Septum mit einer 10 mL Spritze bei 0 oC. Stir das Reaktionsgemisch für 12 h bei RT
    5. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 0-10 Mbar Unterdruck bei 50 oC.
    6. Die krude Mischung mit 30 mL von DCM auflösen und die Lösung mit gesättigten wässrigen Nahco33 (2 x 20 mL) in einem 50 mL separatory Trichter zu extrahieren.
    7. Extrahieren Sie erneut die wässrige Schicht mit DCM (3 x 15 mL). Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer.
    8. Eine Lösung des Produktes in etwa 2 mL der DCM auf C18 Kieselsäure Bett zu laden. Die Spalte mit einer Mischung aus Wasser und Methanol eluieren (0 - 100 % Methanol in Wasser) und Bruchteile von 5-10 mL zu sammeln.
    9. Sammeln Sie die Produkt-Brüche und verdampfen unter vermindertem Druck auf gewünschte Produkt als weißer Schaum.
    10. Das Produkt in 5 mL trockenem Methanol in einer 25 mL Runde untere Kolben auflösen und mit einem Gummiseptum verschließen.
    11. Transfer von 0,1 mL Natrium метоксида (NaOMe) in Methanol und Cool zum 0 oC mit einem Eisbad und rühren Sie die Mischung für 12 h.
    12. Entfernen Sie das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer und trocknen Sie das Produkt unter Hochvakuum.
    13. Die rohe Produkte in 5 mL Methanol auflösen: H2o: Essigsäure (6:3:1).
    14. Fügen Sie Palladium Hydroxid (Pd(OH)2) (50 % von wt) und rühren Sie die Reaktion unter Wasserstoffatmosphäre mit einem Wasserstoff-Ballon für 15 h.
    15. Die Reaktion durch eine Celite Bett filtern und mit 2 mL Methanol, gefolgt von 2 mL Dd Wasser waschen.
    16. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer.
    17. Die krude Mischung mit etwa 1 mL Wasser auflösen und laden Sie sie auf dem Gelbett Polyacrylamid-(siehe Tabelle der Materialien). Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie Bruchteile von 1-2 mL.
    18. Die gesammelten Fraktionen von TLC zu überwachen, entwickeln mit n-Butanol: H2o: Essigsäure (1:1:1).
    19. Die Produkt-Fraktionen zu sammeln und erhalten Sie das gewünschte Produkt 10, 5-Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)-(lyophilize α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside (0.002 g, 36%), as a weißes Pulver.
    20. Das Produkt von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) zu charakterisieren.

3. Vorbereitung von Glykoproteinen mit Phosphonic Acid Tail19,22

  1. Wiegen der jeweiligen Glycan (2-5 µmol) in einer 5 mL Rundboden Kolben, eine magnetische Stir Bar hinzufügen und mit einem Gummiseptum cap.
  2. Übertragen Sie 400 µL frisch getrocknete Dimethylformamid.
  3. Hinzufügen [2 (2 (2 (BIZ (c(2)-OBN-Gruppe) Phosphoryl) Ethoxyethoxy) Ethyl (2, 5-dioxopyrrolidin1-Yl) Karbonat] (10-25 µmol, im Haus zubereitet), die Glycan-Lösung. Rühren Sie die Mischung mit 800 u/min für 5 h.
  4. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 5-10 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
  5. Das Reaktionsgemisch in 0,5 mL Wasser auflösen und laden an der Spitze des Bettes Polyacrylamid-Gel (siehe Tabelle der Materialien). Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie Bruchteile von 1-2 mL.
  6. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC26. Vor Ort das Reaktionsgemisch auf einer TLC Platte, und fügen Sie Fleck-Lösung von 0,25 M Cerium Ammonium Molybdat; Folgen Sie durch Erhitzen mit einer Heizplatte. Sammeln Sie das Produkt mit Fraktionen und lyophilize um das gewünschte Produkt als weißes Pulver zu erhalten.
  7. Das Produkt in 2 mL Wasser auflösen und Pd (OH)2 (50 % nach Gewicht) hinzufügen. Rühren Sie die Reaktion bei 800 u/min unter Wasserstoffatmosphäre mit einem Wasserstoff-Ballon für 15 h.
  8. Die Reaktion durch ein Flussmittel kalziniert Bett zu filtern und mit 2 mL Methanol, gefolgt von 2 mL destilliertem deionisiertes Wasser waschen. Verdunstet das Lösungsmittel mit einem Drehverdampfer bei 300 Mbar Unterdruck bei 40 oC.
  9. Die krude Mischung mit etwa 1 mL Wasser auflösen und laden Sie sie auf dem Gelbett Polyacrylamid-(siehe Tabelle der Materialien).
  10. Eluieren Sie das Produkt mit Wasser und sammeln Sie Bruchteile von 1-2 mL. Überwachen Sie die gesammelten Fraktionen von TLC26. Lyophilize Fraktionen (das Produkt mit flüssigem Stickstoff eingefroren, dann legen Sie auf Gefriertrockner unter Vakuum) um das gewünschte Produkt als weißes Pulver zu erhalten. Die Produkte von NMR und Massenspektroskopie (siehe zusätzliche Datendatei) mit D2O als Lösungsmittel zu charakterisieren.

4. Glycan Array

  1. Vorbereitung der Aluminium beschichtete Glasplatten (ACG-Folie) 19 , 20 , 22
    Hinweis: Herstellung von Aluminium-beschichtete Objektträger erfolgte am Thin Film Technology Division, Instrument Technology Research Center und nationalen angewendet Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan.
    1. Beschichtete Folien zu verpacken, Vakuum-Versiegelung zu verhindern die Bildung von NAO und halten bis der elektrochemischen Reaktion für Oberfläche Anodisierung versiegelt.
  2. Surface Anodisierung Aluminium beschichtete Objektträger 19 , 20 , 22
    1. Den temperaturgesteuerten Inkubator bei 4 ° c eingestellt Bereiten Sie 0,3 M Oxalsäure wässrigen Lösung vor und halten Sie es in ein Eisbad. Nehmen Sie die 500 mL-Becherglas, fügen Sie eine Magnetrührer Bar.
    2. Übertragen Sie die Oxalsäure 0,3 M, 500 mL-Becherglas zu, und platzieren Sie einen 10 cm lange Platin Stab als einer Kathode in die Lösung. Rühren (bei 300 u/min) die Oxalsäure Verlauf der Anodisierung.
    3. Lab-Tracer-Software aktivieren Sie, klicken Sie auf die Schaltfläche "einrichten" dann "Funktion Wahl Sweep Spannung." Die Start- und stop Spannung auf 25,8 V, Anzahl der Punkte auf 100, Einhaltung von 1, und fegen Verzögerung bis 1.200 ms und klicken Sie auf "ok".
    4. Klemmen Sie in Richtung der Kathode Aluminium-beschichtete Glas zugewandte. Klicken Sie auf "run-Test". Beobachten Sie die aktuelle Messung (ca. 8-10 mA).
    5. Nach Oberfläche Anodisierung Objektträger mit doppelt destilliertem Wasser gründlich abspülen, trocken mit Stickstoffgas bereinigen und dann in eine 30 % Relative Feuchte Kammer bis zum späteren Gebrauch speichern.
  3. Herstellung von ACG Glycan microarray 22
    1. Bereiten Sie individuell in Ethylenglykol bei 10 mM Konzentration 100 µL alle monovalenten Glykoproteinen (I-XI).
    2. Verdünnen Sie die oben genannten Glycan mit Drucken Puffer (80 % Ethylenglykol und 20 % deionisiertes Wasser) um 100 µM Konzentration zu machen.
    3. Bereiten Sie für Hetero-Liganden Studie 5 µL der einzelnen I-XI Glykane, und jeder fügen Sie 5 µL der Mann5GlcNAc2 (1:1 Verhältnis hinzu).
    4. Print Microarrays durch Roboter-pin (siehe Tabelle der Materialien), durch die Ablagerung von 0,6 nL die vorbereitete Glykane auf ACG gleitet31.
    5. Speichern Sie die bedruckten Folien in eine Luftfeuchtigkeit kontrolliert trockene Box vor der verbindlichen Test.
  4. Mapping-Glycan Epitope von HIV-1 im großen und ganzen neutralisierende Antikörper PG9 22
    1. Bereiten Sie 1 mL BSA enthaltenen PBST Puffer, 3 % w/V.
    2. Bereiten Sie 70 µL PG9 (50 µg/mL) in PBST Puffer (BSA enthalten PBST Puffer, 3 % w/V).
    3. Bereiten Sie 120 µL Nebenstil fluoreszierende Antikörper Esel Anti-Human-IgG (Alexa Fluor 647 konjugiert) 50 µg/mL in PBST Puffer (BSA enthalten PBST Puffer, 3 % w/V) im Dunkeln.
    4. Mischen Sie Primärantikörper (PG9) und Nebenstil fluoreszierenden Antikörper im Verhältnis 1:1 (60 µL). Inkubieren Sie vorgemischte Antikörper für 30 min bei 4 ° c
    5. Laden Sie die ACG-Folie in die Folie Inkubation Kammer unterteilt in 16 Brunnen. 100 µL vorgemischten Antikörper auf die Glycan-Array übertragen und bei 4 ° C für 16 h inkubieren.
    6. Pipettieren, vorgemischte Antikörper. Entfernen Sie die Folie Inkubation Kammer.
    7. Waschen Sie die Folie zuerst in PBST Puffer (PBS und 0,05 % Tween-20), gefolgt von deionisiertes Wasser und Spin bei 2.000 x g trocknen.
    8. Die Microarray Bildanalyse-Software zu öffnen (siehe Tabelle der Materialien). Fügen Sie eine Folie mit den angeordneten Funktionen nach unten.
    9. Klicken Sie auf das Menü "Einstellungen", legen Sie die Bildauflösung auf 5 µm pro Pixel und die Wellenlänge bei 635 nm mit PMT450 und Kraft zu 100 %.
    10. Klicken Sie auf "Scan" starten imaging der Folie.
    11. Klicken Sie auf "Datei", um das Bild im Tif-Format zu speichern.
    12. Durchführen Sie Bildanalyse durch Anschluss an die Software-Anwender Handbuch32.
    13. Berechnen Sie die Gesamtintensität der Fluoreszenz und illustrieren mit Bildverarbeitungs-Software33 (siehe Tabelle der Materialien).
      Hinweis: Hier ist der durchschnittliche Prozentsatz Fehler für alle Datenpunkte von Fehlerindikatoren präsentiert.

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Representative Results

Chemo-enzymatische Modulstrategie für die Synthese eines breiten Spektrums von N -Glykanen ist in Abbildung 1dargestellt. Die Strategie ist, dass Vielfalt von Chemo-enzymatische Synthese der drei wichtige Module, gefolgt von der α-spezifische Mannosylation an der 3-O und/oder 6-O am Anfang erstellt werden kann Position der Mannose-Reste des gemeinsamen Kern Trisaccharide von N- Glykanen. Angesichts der strukturellen Vielfalt der BI-, Tri- und Tetra-antennary komplexer Typ N- Glycan Strukturen glaubten wir, dass eine Reihe von Oligosaccharyl Gebern und den Kern Trisaccharides Akzeptor mit vorinstallierten Alkyl-Handlecould als Ausgangspunkt verwendet werden Materialien, die gewünschte Strukturvielfalt (Abbildung 1) zu generieren. Die Anwendbarkeit der a1 Fluorid Spender im Aufbau einer komplexen Glycan-Bibliothek ist bereits21nachgewiesen worden.

Um die Wirksamkeit unserer Strategie zu demonstrieren, wurde eine Bi-antennary Isomeren Struktur (10, Abbildung 3) für die Synthese ausgewählt. Die D1 Arm Antennen 4 und D2 Arm Antennen 5 von Glycan 10 wurden auf großen Skalen durch Chemo-enzymatische Methoden erzeugt. Insbesondere war das Disaccharid Akzeptor 1 enzymatisch galactosylierte mit β-1, 4-Galactosyltransferase und Uridin 5'-Diphosphogalactose (UDP-Gal) Trisaccharide 2zu bilden. Als nächstes wurde der Mittelstufe 2 Fucosylated an GlcNAc 3 -O -Position in Gegenwart von α-1, 3-Fucosyltransferase von Helicobacter Pylori (Hpα1, 3 FT), die gewünschte Tetrasaccharide 3leisten können. Für chemische Verbindung zum Kern Bausteine 2 und 3 wurden erste Peracetylated, und der reduzierenden Ende p- Phenol Methoxygruppe wurde entfernt. Zu guter Letzt wurde Fluorid in Anwesenheit von DAST bzw. zu der gewünschten Module 4 und 5, installiert (Abbildung 2).

Nachdem die gewünschten Module in der hand, gehen wir weiter auf die Stereoselective 3 -O -Glykosylierung 4 Core Trisaccharide 6 unter Katalyse von Silber triflate und Hafnocene Paraquatdichlorid zu den jeweiligen Hexasaccharide 7 (Abbildung 3). Der Benzylidene Schutz, dass Maskierung 4, 6-OH entfernt wurde mit katalytischen p-Toluol Sulfonsäure (p- TSA). Unter Ausnutzung seiner Reaktivität, primäre 6-OH 8 war mit Fluorid Modul 5 unter ähnlichen Versuchsbedingungen Erreichung der erforderlichen Decasaccharide 9reagiert. Endlich wurde global Deprotection durchgeführt, um Glycan 10, welche mit NMR und Massenspektroskopie (siehe die zusätzliche Datendatei) weiter charakterisiert war.

Glykane, enthält einen Pentyl Amin Schweif an der reduzierenden Ende wurden mit phosphonic Acid Linker geändert und an ACG Oberfläche durch Phosphonat Chemie (Abbildung 4). Am letzten, HIV-1 bNAb lief PG9 für seine Glycan Spezifität mit Homo und Hetero-Glykane Arrays um zum ersten Mal zu demonstrieren, der PG9 mit angrenzenden Heteroglycans in der V1/V2-Schleife von HIV-1 gp120 Oberfläche (Abbildung 5) interagiert.

Figure 1
Abbildung 1: Eine modulare Gesamtstrategie für die Zubereitung von N- Glykanen. (A) die Anzahl der N- Glykane generiert durch diese Strategie, die häufig auf menschlichen Glykoproteinen auftreten wird voraussichtlich 20.000 überschreiten. (B) drei Arten von Modulen vorbereitet durch diese Chemo-enzymatische Vorgehensweise, die für α-Seletive Glykosylierungen verwendet werden kann. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Chemoenzymatic Synthese der Module. i, UDP-Galactose, β 1, 4-GalT, 15 h, 86 %; Ii, BIP-Fucose, α 1, 3-FucT, 15 h, 84 %; III, (1) Ac2O, Pyridin, RT, 12 h; (1) kann ACN: Toluol: H2O, (3) DAST, CH2Cl2,-30 oC. können: Cerium Ammoniumnitrat; DAST: Diethylaminosulfur Trifluoride.
Produktnomenklatur: 1, p-methoxyphenyl-O-2-acetamido-2-deoxy-β-D-Glucopyranosyl-(1→ 2)-α-D-Mannopyranoside; 2, p-methoxyphenyl-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-Deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranoside; 3, p-O-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-[α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-α-D-mannopyranoside - Methoxyphenyl; 4, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl Fluorid; 5, [2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-L-fucopyranosyl(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl Fluor Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: chemische Glykosylierung von D1/D2 Arm Module zu Kern-Akzeptor. Ich, 4, AgOTf, Cp2HfCl2, Toluol, 4 Å MS, 0 oC, RT, 70 %; Ii, p- TSA, Acetonitril, RT, 57 %; III, 5, AgOTf, Cp2HfCl2, Toluol, 4 Å MS, 0 oC, RT, 34 %; iv, (1) LiOH, 1,4-Dioxan: H2O; 90 oC, 12 h; (2) Ac2O, Pyridin, 12 h; (3) NaOMe, MeOH, 12 h; (4) Pd(OH)2, MeOH: H2O: HCOOH (5:3:2), H2, 36 %. AgOTf: Silber Trifluromethanesulfonate; CP2HfCl2: BIZ (Cyclopentadienyl) Hafnium Paraquatdichlorid, MS: Molekularsiebe, Produktnomenklatur: 7, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2- acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-[2-O-Acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy) carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosid. 8, 5-Azidopentyl - O-(2-O-Acetyl-3,4,6-Tri-O-benzyl-α-D-mannopyranosyl-(1→3)-2-O-acetyl-4,6-O-benzylidine-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-O-(3,6-di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6- di-O-benzyl-2-deoxy-2-phthalimido-β-D-glucopyranoside. 9, 5-Azidopentyl-O-{[2,3,4,6-O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-[3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl]}-(1→3)-{2,3,4,6- O-tetraacetyl-β-D-galactopyranosyl]-(1→4)-[2,3,4-O-triacetyl-α-LS160fucopyranosyl-(1→3)-3,6-O-diacetyl-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl]-(1→2)-3,4,6-O-triacetyl-α-D-mannopyranosyl}-(1→6)-[2-O-acetyl-β-D-mannopyranosyl-( 1→4)-O-(3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-D-glucopyranosyl)-(1→4)-O-3,6-di-O-Benzyl-2-deoxy-2-(2,2,2-trichloroethoxy)carbonylamino-β-Dglucopyranoside 10, 5- Aminopentyl-β-D-galactopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-D-mannopyranosyl]-(1→3),-[β-D-galactopyranosyl-(1→4)(α-L-fucopyranosyl-(1→3)-2-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl)-(1→2)- Α-D-mannopyranosyl]-(1→6)-β-D-mannopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-2-acetamido-2-deoxy-β-D-glucopyranoside Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Glycan Immobilisierung auf ein Array von ACG. (A) chemische Modifikation von Glycan amino Schwanz in einem phosphonic Acid tail für kovalente Bindung an die ACG-Folie durch Phosphonat Chemie. (B) Vertrieb von Glykoproteinen auf eine ACG-Oberfläche. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Glyan-Array-Analysen. (A) Strukturen der synthetischen N- Glykane, die auf eine ACG-Array gedruckt werden. (B) Analyse der PG9 verbindlich, um individuelle Glykane I-XI auf ACG-Array (linken) gedruckt und Glycan Mischungen von Mann5 mit Glykoproteinen I-XI (rechte Abbildung) mit 100 µM Konzentration gemischt. Die Molaren Konzentrationen in µM für PG9 sind in der Legende angegeben. Die mittlere Signalintensitäten und Standardfehler berechnet für fünf unabhängige Wiederholungen auf dem Array werden angezeigt. Kartenausschnitte zeigen Fluoreszenzbilder. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Eine Klasse von HIV-1-bNAbs einschließlich PG9, PG16 und PGMs 128 141-145 wurden berichtet, hochwirksame bei der Neutralisierung von 70-80 % der zirkulierenden HIV-1-Isolate. Die Epitope von diesen bNAbs sind unter den Varianten der gesamten HIV-1 Gruppe M hoch konserviert, deshalb können sie leiten die effektive Immunogen Gestaltung eines HIV-Impfstoffs neutralisierende Antikörper23,24,25 zu entlocken . Als Teil unserer Bemühungen, die Glycan Epitope von HIV-1 breit neutralisierenden Antikörpern zu identifizieren haben wir die chemische und enzymatische Synthese eines Panels von hohen Mannose, Hybrid- und komplexen Typ Oligosaccharide bilden eine Glycan Array21berichtet, 22. Allerdings sind die häufig verwendeten Glycan-Arrays auf N- Hydroxysuccinimide-beschichtet (NHS) Glas-Objektträger nicht geringe Affinität Kohlenhydrat-Protein-Wechselwirkungen, wahrscheinlich aufgrund der heterogenen Glycan Verteilung durch Hydrolyse von erkennen reaktive N- Hydroxysuccimide Funktionsgruppen auf seiner Oberfläche. Um die Grenzen der konventionellen Array Formate zu überwinden, haben wir eine Glycan-Array auf eine Aluminiumoxid beschichtet Glas (ACG) Folie entwickelt. Weiter führten wir einen Homogenität Vergleich zwischen der ACG-Array und die gängigen NHS Array zu beweisen, dass das ACG-Array eine homogenere Glycan-Präsentation auf ihrer Oberfläche22angeboten. Unsere vorläufige Bindung Analyse konnte nicht verbindliche PG9 zu den Glykoproteinen auf NHS-Array (Daten nicht gezeigt) zu beobachten. Um die Spezifität der Bindung der PG9 zu definieren, wurden daher Glykane I-XI an einen phosphonic Acid Schweif und gedruckt auf der ACG-Folie mit 100 µM der einzelnen Glykoproteinen (Abbildung 4). Die Glycan Immobilisierung auf eine ACG-Folie durch Phosphonat Chemie angeboten eine stabile und homogene Verteilung. Jeder der den Glykoproteinen wurde gedruckt mit fünf Wiederholungen und Folie Bilder stammen aus einem Fluoreszenz-Scan nach DyLight649 konjugiert Esel Anti-Human-IgG Antikörper Inkubation. Die Bindung Analyse der PG9 gegenüber einzelnen Glykane gedruckt auf ACG-Array (Abbildung 5, linken) legt nahe, dass PG9 stark mit Hybrid-Typ validieren (X) interagiert. Die Interaktionen wurden auch für hohe Mannose Typ Man5 erkannt (Glycan IV) und der Komplex-Typ validieren (XI).

Die molekularen Ebene Wechselwirkungen zwischen PG9 und Hybrid-Typ validieren (X) sind schwer zu bestimmen, aufgrund der fehlenden Kenntnisnahme Co Kristall-Struktur. Der Hybrid-Typ Glycan X besteht aus einem Komplex-Typ Arm am 3-O -Position des Kerns und einem Trimannose Arm verbunden der 6-O position des zentralen Trisaccharide. Bindung von PG9 Hybrid Glycan X legt nahe, dass PG9 Mannose und Sialinsäure Säure Rückstände in unmittelbarer Nähe für hohe Affinität Interaktion erfordert. Um die Glycan-Kombination zu identifizieren, die am besten in der Bindungstasche PG9 passt, haben wir eine gemischt-Glykan-Array-Studie durchgeführt. Glycan IV wurde mit jeder Glycan aus I-XI im Verhältnis 1:1 Mol gemischt und auf eine ACG-Reihe entdeckt. Die Bindung Analyse der PG9 aller Mischungen angegeben, dass eine Kombination von Mann5 und einem SCT (IV + XI) die höchste Affinität zu PG9 im Vergleich zu IV oder XI allein geführt. Darüber hinaus entdeckt Mischungen, die Man5 und solche mit Sialylated Antennen wie auch Glykane VIII und X waren22. Zum ersten Mal bot diese Ergebnisse einen Array basierten Nachweis für Hetero-Glykane Bindungsverhalten von PG9, die von Kristall Struktur Studien mit HIV-1 gp120 V1/V2 Domäne23PG9 vorgeschlagen wurde.

Zusammenfassend haben wir eine effiziente modulare Chemo-enzymatische Strategie für die Zubereitung von unterschiedlichsten Ngezeigt-Oligosaccharide, die auf menschlichen Glykoproteinen auftreten verbunden. Darüber hinaus bietet die Entwicklung eines ACG-Arrays ein wirksames Mittel zu bestimmen, extrem schwache Kohlenhydrat-Protein-Interaktionen und noch wichtiger ist, die Interaktionen, die durch Hetero-Glykane auftreten.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die Autoren danken den Thin Film Technology Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) und nationalen angewendet Research Laboratories, Hsinchu Science Park, Taiwan. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die National Science Council (keine zu gewähren. Die meisten 105-0210-01-13-01) und Academia Sinica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic acid Sigma Aldrich 64197
Acetonitrile Sigma Aldrich 75058
Acetic anhydride Sigma Aldrich 108247
Anhydrous magnesium sulfate Sigma Aldrich 7487889
Boron trifluoride ethyl etherate Sigma Aldrich 109637
Bovine serum albumin Sigma Aldrich 9048468
Bio-Gel P2 polyacrylamide Bio-Rad 1504118
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride Sigma Aldrich 12116664
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk Sigma Aldrich 48279
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) Arrayit
Cerium ammonium molybdate TCI C1794
Cerium ammonium nitrate Sigma Aldrich 16774213
Clean glass slide  Schott 
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid Sigma Aldrich 3063716
Deuterated chloroform Sigma Aldrich 865496
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated Jackson Immuno Research, USA 709605098
Dichloromethane Sigma Aldrich 75092
Diethylaminosulfur trifluoride Sigma Aldrich 38078090
Dimethylformamide Sigma Aldrich 68122
Ethyl acetate Sigma Aldrich 141786
Ethylene glycol Acros Organic 107211
FAST frame slide incubation chambers Sigma Aldrich
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt  Sigma Aldrich 15839700
Lab tracer 2.0 software  Section 4 of the Protocol
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) moleculardevices www.moleculardevices.com
GraphPad Prism Software (Image processing ) GraphPad Software, Inc http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/
Lithium hydroxide Sigma Aldrich 1310652
Manganese chloride Sigma Aldrich 7773015
Methanol Sigma Aldrich 67561
N-butanol Sigma Aldrich 71363
Oxalic acid Acros Organic 144627
Palladium hydroxide Sigma Aldrich 12135227
Phosphate Buffered Saline Thermo Fisher Scientific  10010023
Pyridine Sigma Aldrich 110861
P-Toluene sulfonic acid monohydrate Sigma Aldrich 773476
Silver triflate Sigma Aldrich 2923286
Sodium bicarbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium chloride Sigma Aldrich 7647145
Sodium hydrogen carbonate Sigma Aldrich 144558
Sodium methoxide  Sigma Aldrich 124414
Sodium sulfate Sigma Aldrich 7757826
Toluene  Sigma Aldrich 108883
Tris buffer  Amresco N/A Ultra-pure grade
Tween-20 Amresco 9005645
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) Sigma Aldrich 137868521

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Chemie Ausgabe 132 Chemo-enzymatische Synthese ACG-Glykan-Arrays HIV neutralisierenden Antikörpern N- Glykane Spezifität Profilierung modularen Ansatz
Chemo-enzymatische Synthese von <em>N</em>- Glykanen für Array-Entwicklung und HIV-Antikörper-Profiling
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Shivatare, S. S., Shivatare, V. S.,… More

Shivatare, S. S., Shivatare, V. S., Wu, C. Y., Wong, C. H. Chemo-enzymatic Synthesis of N-glycans for Array Development and HIV Antibody Profiling. J. Vis. Exp. (132), e55855, doi:10.3791/55855 (2018).

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