En modulær tilnærming til syntesen av N– glykaner for å feste til en aluminiumoksid-belagt glass skyve (ACG lysbilde) som en glycan microarray er utviklet og bruk for profilering av en HIV bredt nøytralisere antistoffer har vist.
Vi presenterer en svært effektiv måte for rask utarbeidelse av et bredt spekter av N-koblet oligosaccharides (estimert overstiger 20.000 strukturer) som ofte finnes på menneskelig glykoproteiner. For å oppnå ønsket strukturelle mangfoldet, strategien begynte med kjemoterapi-enzymatisk syntesen av tre typer oligosaccharyl fluor moduler, etterfulgt av deres gradvis α-selektiv glycosylations på den 3-O og 6-O stillinger på den mannose rester av den felles kjerne trisaccharide har en avgjørende β-mannoside kobling. Vi ytterligere knyttet N– glykaner på overflaten av en aluminiumoksid-belagt (ACG) objektglass opprette en kovalente blandet matrise for analyse av hetero-ligand interaksjon med et HIV antistoff. Spesielt type bindingsmåte av en nylig isolert HIV-1 bredt nøytraliserende antistoff (bNAb), PG9, blandingen av tett linjeavstand mann5GlcNAc2 (mann5) og 2,6-di-sialylated bi-antennary kompleks N– glycan (SCT ) på en ACG matrise, åpner en ny vei å veilede effektiv immunogen design for HIV vaksineutvikling. I tillegg bærer våre ACG matrise et kraftig verktøy for å studere andre HIV antistoffer hetero-ligand binding oppførsel.
N– glykaner på glykoproteiner kobles covalently til asparagine (Asn) rester av konsensus Asn-Xxx-Ser/Thr sequon, som påvirker flere biologiske prosesser som protein konformasjon, antigenicity, løselighet og Lektiner anerkjennelse 1 , 2. kjemisk syntesen av N-koblede oligosaccharides representerer en betydelig syntetiske utfordring på grunn av deres store strukturelle mikro heterogenitet og svært forgrenet arkitektur. Nøye utvalgte beskytte grupper for å tune reaktivitet av byggeklosser, oppnå selektivitet anomeric sentre, og riktig bruk av arrangøren / activator(s) er viktige elementer i syntesen av komplekse oligosaccharides. For å løse dette problemet med kompleksiteten, en god mengde arbeid å fremme N– glycan syntese ble rapportert nylig3,4. Til tross for disse robust tilnærminger, finne en effektiv metode for utarbeidelse av en rekke N– glykaner (~ 20 000) fortsatt en stor utfordring.
Rask Mutasjonshastigheten av HIV-1 omfattende genetisk mangfold og dens evne til å flykte fra nøytralisere antistoffet svaret, er blant de største utfordringene å utvikle en sikker og forebyggende vaksine mot HIV-15,6 , 7. en effektiv taktikk som HIV bruker å unngå immunrespons vert er den post-translasjonell glykosylering av konvolutten glykoprotein gp120 med en variert N-koblet glykaner avledet fra verten glykosylering maskiner8, 9. En fersk rapport om nøyaktig analyse av rekombinant monomerisk HIV-1 gp120 glykosylering fra menneskelige embryonale (HEK) 293T nyreceller antyder forekomsten av strukturelle microheterogeneity med en karakteristisk celle-spesifikke mønster10 , 11 , 12. derfor forståelse glycan særegenheter av HIV-1 bNAbs krever også preget gp120 knyttet N– glycan strukturer i et antall tilstrekkelig for analyse.
Oppdagelsen av glycan microarray teknologi gitt høy gjennomstrømming-baserte utforskning av spesifisiteter av en rekke ulike karbohydrat-bindende proteiner, virus/bakteriell adhesins, toksiner, antistoffer og lectines13,14 . Systematisk glykaner ordningen i et plassert chip-basert format kan fastslå problematisk lav affinitet protein-glycan vekselsvirkningene gjennom multivalent presentasjon15,16,17,18. Chip-baserte glycan ordningen beleilig vises å etterligne effektivt celle-celle grensesnitt. Å berike teknologien og overvinne ujevn spørsmålet forbundet med konvensjonelle matrise formater, utviklet vår gruppe nylig et glycan utvalg på aluminiumoksid-belagt glass (ACG) lysbilder med phosphonic syre-slutt glykaner for å forbedre signal intensiteten, homogenitet og følsomhet19,20.
For å forbedre gjeldende forståelse glycan epitopes nylig isolert HIV-1 bredt nøytralisere antistoffer (bNAbs), har vi utviklet en svært effektive modulbaserte strategi for utarbeidelse av en rekke N-koblet glykaner21 ,22 skal skrives ut på en ACG Skyv (se figur 1). Spesifisitet profilering studier av HIV-1 bNAbs på tabelldata ACG tilbys uvanlig påvisning av hetero-glycan binding virkemåten til svært potent bNAb PG9 som ble isolert fra HIV infisert enkeltpersoner23,24,25.
En klasse av HIV-1 bNAbs inkludert PG9, PG16 og PGTs 128, 141-145 ble rapportert å være svært potent i å nøytralisere 70-80% av sirkulerende HIV-1 isolater. Epitopes av disse bNAbs er svært bevart blant variantene av alle HIV-1 M, derfor de kan guide effektiv immunogen design for en HIV vaksine å lokke fram nøytraliserende antistoffer23,24,25 . Som en del av å identifisere glycan epitopes av HIV-1 bredt nøytralisere an…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takke tynn Film Technology Division, Instrument Technology Research Center (ITRC) og National anvendt forskningslaboratorier, Hsinchu Science Park, Taiwan. Dette arbeidet ble støttet av National Science Council (gi nei. De fleste 105-0210-01-13-01) og Academia Sinica.
Acetic acid | Sigma Aldrich | 64197 | |
Acetonitrile | Sigma Aldrich | 75058 | |
Acetic anhydride | Sigma Aldrich | 108247 | |
Anhydrous magnesium sulfate | Sigma Aldrich | 7487889 | |
Boron trifluoride ethyl etherate | Sigma Aldrich | 109637 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | 9048468 | |
Bio-Gel P2 polyacrylamide | Bio-Rad | 1504118 | |
Bis(cyclopentadienyl)hafnium(IV) dichloride | Sigma Aldrich | 12116664 | |
β-1, 4 Galactosyl transferases from bovine milk | Sigma Aldrich | 48279 | |
BioDot Cartesion technology with robotic pin SMP3 (Stealth Micro Spotting Pins) | Arrayit | ||
Cerium ammonium molybdate | TCI | C1794 | |
Cerium ammonium nitrate | Sigma Aldrich | 16774213 | |
Clean glass slide | Schott | ||
Cytidine-5′-monophospho-N-acetylneuraminic acid | Sigma Aldrich | 3063716 | |
Deuterated chloroform | Sigma Aldrich | 865496 | |
Donkey Anti-Human IgG (Alexa Fluor647 conjugated | Jackson Immuno Research, USA | 709605098 | |
Dichloromethane | Sigma Aldrich | 75092 | |
Diethylaminosulfur trifluoride | Sigma Aldrich | 38078090 | |
Dimethylformamide | Sigma Aldrich | 68122 | |
Ethyl acetate | Sigma Aldrich | 141786 | |
Ethylene glycol | Acros Organic | 107211 | |
FAST frame slide incubation chambers | Sigma Aldrich | ||
Guanosine 5'-diphospho-b-L-fucose disodium salt | Sigma Aldrich | 15839700 | |
Lab tracer 2.0 software | Section 4 of the Protocol | ||
GenePix Pro 4300A reader (microarray image analysis) | moleculardevices | www.moleculardevices.com | |
GraphPad Prism Software (Image processing ) | GraphPad Software, Inc | http://www.graphpad.com/guides/prism/6/user-guide/ | |
Lithium hydroxide | Sigma Aldrich | 1310652 | |
Manganese chloride | Sigma Aldrich | 7773015 | |
Methanol | Sigma Aldrich | 67561 | |
N-butanol | Sigma Aldrich | 71363 | |
Oxalic acid | Acros Organic | 144627 | |
Palladium hydroxide | Sigma Aldrich | 12135227 | |
Phosphate Buffered Saline | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
Pyridine | Sigma Aldrich | 110861 | |
P-Toluene sulfonic acid monohydrate | Sigma Aldrich | 773476 | |
Silver triflate | Sigma Aldrich | 2923286 | |
Sodium bicarbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 7647145 | |
Sodium hydrogen carbonate | Sigma Aldrich | 144558 | |
Sodium methoxide | Sigma Aldrich | 124414 | |
Sodium sulfate | Sigma Aldrich | 7757826 | |
Toluene | Sigma Aldrich | 108883 | |
Tris buffer | Amresco | N/A | Ultra-pure grade |
Tween-20 | Amresco | 9005645 | |
Uridine diphosphate galactose (UDP-galactose) | Sigma Aldrich | 137868521 |