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Neuroscience

Ein Protokoll für die Messung von Cue Reaktivität in einem Rattenmodell der Kokain-Gebrauch-Störung

Published: June 18, 2018 doi: 10.3791/55864
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4,5, 1,6, 1,6, 1,6, 1,6, 1,3,4
1Center for Addiction Research, University of Texas Medical Branch, 2Institute for Translational Sciences, University of Texas Medical Branch, 3Mitchell Center for Neurodegenerative Diseases, University of Texas Medical Branch, 4Department of Neurology, University of Texas Medical Branch, 5Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 6Department of Pharmacology and Toxicology, University of Texas Medical Branch
* These authors contributed equally

Summary

Cue-Reaktivität ist konzipiert als Sensibilität für Hinweise im Zusammenhang mit Drogen Erfahrungen, die dazu beitragen, Begierde und Rückfall in abstinent Menschen. Cue Reaktivität ist bei Ratten durch Messung Aufmerksamkeits Ausrichtung auf Drogen-assoziierten Cues modelliert, die Ergebnisse in faszinierendem Ansatz Verhalten in einem Cue Reaktivität Test nach Selbstverwaltung und Abstinenz gezwungen.

Abstract

Kokain-Gebrauch-Störung (CUD) folgt eine Flugbahn des sich wiederholenden Selbstverwaltung, in denen zuvor neutrale Reize Incentive-Wert zu gewinnen. Cue Reaktivität, die Sensibilität für Hinweise, die zuvor im Zusammenhang mit Drogenkonsum Erfahrung, spielt eine herausragende Rolle im menschlichen verlangen während der Abstinenz. Cue Reaktivität kann als die Aufmerksamkeits Ausrichtung auf Drogen-assoziierten Cues beurteilt werden, die als faszinierendem Ansatz Verhalten in präklinischen und menschliche Studien messbar ist. Hierin beschreibt eine Bewertung der Cue Reaktivität bei Ratten ausgebildet, um Kokain selbst verabreichen. Kokain Selbstverwaltung paart sich mit der Präsentation der diskrete Signale, die als konditionierten Verstärker (d.h., Haus Licht, Anregung Licht, Infusion Pumpe klingt) fungieren. Nach einer Zeit der Abstinenz werden Hebel Pressen im Zusammenhang mit Kokain Selbstverwaltung durch die diskrete Signale zuvor gepaart mit Kokain Infusion begleitet als Cue Reaktivität gemessen. Dieses Modell eignet sich zu neurobiologischen Mechanismen Cue Reaktivität Prozesse sowie hinsichtlich um Pharmakotherapien Cue Reaktivität zu unterdrücken und ändern daher Rückfall Schwachstelle zu bewerten. Vorteile des Modells sind die translationale Relevanz und ihr Gesicht und vorausschauende Gültigkeiten. Die größte Einschränkung des Modells ist, dass der Cue Reaktivität Aufgabe nur selten durchgeführt werden kann und nur in kurzen Dauer verwendet werden dürfen (zB., 1 Std.), ansonsten startet Ratten, die Paarung der diskreten Cues mit dem Kokain Reiz zu löschen. Das Modell ist erweiterbar auf alle positiv verstärkenden Reiz gepaart mit diskreten Signale; Obwohl vor allem für Drogen, kann dieses Modell zukünftige Anwendungen in Bereichen wie Übergewicht, zu halten wo schmackhaft Essen Belohnungen als positiv verstärken Reize dienen kann.

Introduction

Kokain-Gebrauch-Störung (CUD) folgt eine Flugbahn des sich wiederholenden Selbstverwaltung, bei denen zuvor neutrale Reize Incentive-Wert1zu gewinnen. Cue-Reaktivität ist die Empfindlichkeit auf Hinweise, die zuvor im Zusammenhang mit Drogen-Erfahrung, und es spielt eine wichtige Rolle im menschlichen Verlangens2,3,4,5. Das Risiko der Progression, CUD, sowie Rückfall während der Abstinenz, wird angenommen, dass höher bei Personen, die hohen Empfindlichkeit auf Droge verbundenen Hinweise6,7Ausdrücken. Ökologischen Zusammenhängen (z.B., Menschen, Gebäude, Musik-Genres) und diskrete Medikament verbundenen Reize (z.B. Utensilien) werden mit den Kokain-Belohnung in Verbindung gebracht; Exposition gegenüber diese Hinweise kann Veränderungen im Gehirn funktionelle Verknüpfung2,8,9 periphere Physiologie (z.B., Herzfrequenz, Hauttemperatur und Hautwiderstand) und Plastizität des Gehirns auslösen. ,10. In anderen Worten, aktiviert Re-Exposition gegenüber Kokain-assoziierten Signale limbische Corticostriatal Schaltungen konditionierte physiologischen und subjektiven Reaktionen hervorrufen, die begehrliche Ansatz (Drug-seeking) Verhalten11,12 fahren ,13,14,15.

Cue-Reaktivität gemessen mit funktionellen bildgebenden Untersuchungen ist prädiktiv Rückfall Sicherheitslücke in Fächern mit CUD16. Cue Reaktivität Messungen in Nager-Modelle dienen als ein Surrogat Maß für Rückfall Risiko und können für translationale Studien genutzt werden. So eine Pharmakotherapie, dass Cue Reaktivität bei Nagetieren möglicherweise sinkt nach vorne als Rückfall-Prävention Behandlung in klinischen Studien am Menschen durchgeführt. Präklinische Modellen mit den erforderlichen translatorischen Verdienst und prädiktive Gültigkeit sind besonders wichtig, da gibt es derzeit keine FDA-zugelassene Pharmakotherapien für CUD17.

Das Nagetier Selbstverwaltung-Verfahren ist der Goldstandard, translationale Modell mit prädiktive Gültigkeit für menschliche Drogenkonsum18 und von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der molekularen und physiologischen Prozessen zugrunde liegenden CUD. Antwort -selbständige Lieferung von Kokain ergeben sich unterschiedliche Verhaltens-, Molekulare und neurochemischen Wirkungen im Vergleich zu Antwort -abhängige Kokain Exposition; zB., Antwort -selbständige Kokain Lieferung erinnert deutlich höhere Sterblichkeit19. Darüber hinaus die neurochemischen folgen Abstinenz von Antwort -abhängige Kokain Selbstverwaltung sind unterscheiden sich von denen ausgelöst durch Abstinenz von Antwort -unabhängige Kokain Lieferung20, 21. so CUD Modelle basierend auf Antwort -abhängige Bereitstellung von Kokain sind überlegene translationale Modelle bei der Beurteilung Cue Reaktivität und damit verbundenen Wirkmechanismen.

Im folgenden Protokoll wird Kokain intravenös über eine innewohnende Intra Vena Katheter geliefert. Allerdings entstanden sind alternative Methoden, um die Droge über Mund- und Inhalation Routen selbst verabreichen. Wichtig ist, Steuern Nager Lieferung des Medikaments, Analog Menschen durch operante Reaktionen. Daher ist hohe Konkordanz zwischen Drogen Self-administered von Nagern und Menschen22. Präklinischen Medikament Selbstverwaltung folgt beschäftigt Hebel drücken, verstärkt durch Drug-Delivery, Response-Raten höher als Fahrzeugkontrolle zu motivieren. Droge-suchenden Verhaltens wird durch Paarung ursprünglich "neutral" Signale (z. B.ein Impuls-Licht oder Ton und der kontextuellen Umfeld, in denen, das Kokain Selbstverwaltung auftritt) mit Kokain Infusion ausgebildet; Diese Hinweise werden konditionierten Verstärker (zur Überprüfung: Cunningham & Anastasio, 201423). Anschließende Re-Exposition gegenüber Kokain-assoziierten Cues löst Droge-suchenden Verhaltens in Nagetiere (d.h.versucht, Kokain durch Drücken auf den zuvor aktiven Hebel zu übermitteln) sowie verlangen und Rückfall in CUD Themen24, 25 , 26 , 27.

In der Regel nutzen Nagetier vorklinik des Droge-suchenden Verhaltens nach Kokain Selbstverwaltung Aussterben Schulung und/oder Medikament Wiedereinstellung innerhalb der Droge verbunden Umwelt28,29, 30 , 31 , 32. Pressen auf den zuvor aktiven Hebel in der Abwesenheit von Drogen und/oder Cue Lieferung in der Regel bilden das Maß der Wiedereinstellung nach Aussterben33,34,35. Im Gegenteil, ist Cue Reaktivität Droge-suchenden Verhaltens bewerteten folgende erzwungenen Abstinenz ohne vorherige Aussterben Training28,36,37,38,39 .

Zielparameter und experimentellen Variablen wurden sorgfältig ausgewählt und überprüft, um verschiedene Aspekte der Neurobiologie des Droge-suchenden und Rückfall-wie Verhalten zu sezieren, und es ist gut etabliert, dass Neuroadaptations Modelle mit unterschiedlich und ohne Aussterben Training 40,41,42,43. Darüber hinaus aus Sicht der translationalen Nagetier Aussterben Ausbildung spiegelt sich nicht in klinischen Umgebungen für CUD da Droge-in Verbindung stehenden Hinweise Stimmung Staaten, Orte und Menschen44enthalten; die einzigartige Kombination aus diese Hinweise sind wahrscheinlich nicht in einem klinischen Umfeld45,46,47erhältlich. So fungiert das Nagetiere Modell beschriebenen als eine bessere parallele der conditio humana als viele der derzeit verfügbaren Modelle.

Im folgenden beschreibt eine validierte Kokain Selbstverwaltung Ausbildung, erzwungene Enthaltsamkeit und Cue Reaktivität Prüfprotokoll für Ratten. Kurz, Ratten werden mit Intra Vena Katheter, ausgebildet, um Kokain oder Kochsalzlösung über "aktive" Hebel drücken, selbst verabreichen implantiert und Erhalt des Kokain oder Kochsalzlösung Stimulus paart sich mit diskreten Licht- und Hinweise dienen als konditionierten Verstärker. Nach 14 Tagen der Kokain-Selbstverwaltung unterliegen Ratten 30 Tage erzwungenen Abstinenz und eine anschließende 60-min-Cue Reaktivität Test in welche, den Hebel drücken gemessen wird. Der Cue-Reaktivität-Test ist ein Surrogat Maß für Kokain-Rückfall-Sicherheitsanfälligkeit beim Menschen.

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Protocol

Alle tierische Manipulationen werden gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren (2011) und mit Zustimmung der institutionellen Animal Care und Use Committee durchgeführt.

(1) Tiere

  1. Akklimatisieren Sie männliche Sprague-Dawley Ratten ca. 8-9 Wochen alt (250-260 g) für mindestens sieben Tage in einer Kolonie Zimmer auf 21-23 ° C und 45-50 % Luftfeuchtigkeit auf einem 12 h Hell-Dunkel-Zyklus (Lichter auf 06:00-18:00 h) gehalten.
  2. Haus zwei Ratten / Käfig und täglich während der gesamten Studie zu behandeln. Nahrung und Wasser Ad Libitum im Hause Käfig in allen Phasen der Studie.
    Hinweis: Essen Einschränkung erhöht die Salienz des Kokain Belohnung48, Kokain-induzierte lokomotorischen Tätigkeit49, potenziert und fungiert als ein Stressor für Wiedereinstellung50 und damit möglicherweise auch Auswirkungen Cue Reaktivität.
  3. Nach dem Zufallsprinzip weisen Sie Ratten Kochsalzlösung oder Kokain Behandlungsgruppen zu.

2. Operation

  1. Legen Sie die Ratte unter Narkose mit einem cocktail mit 8,6 mg/kg Xylazin, 1,5 mg/kg Acepromazine und 43 mg/kg Ketamin in bakteriostatische Kochsalzlösung suspendiert. Bestätigen Sie, dass die Ratte ausreichend betäubt ist, durch seinen Zeh Kneifen und Überwachung motorischen Reflexe und Atmung. Wenden Sie ophthalmologische Salbe direkt auf die Augen, Augentrockenheit zu verhindern an.
    Hinweis: Wenn die Ratte nicht ausreichend betäubt wird es eine motorische Reaktion auf die Zehe Prise aufweisen, und die Ratte Atemfrequenz kann schnell zu erhöhen.
    1. Aseptischen Technik verwenden, während die Ratte unter Narkose ist, Implantat eine intravenöse Katheter in die Halsschlagader mit einer hinteren Halterung mit einer Kanüle verbunden. Können Sie nach der chirurgischen Implantation Ratten, für 5-7 Tage 28,36,37,51erholen.
      Hinweis: Die intravenöse Verabreichungsweg Kokain selbst beim Menschen führt zu raschen Anstieg der Gehirn Kokain Level52,53. So sind in einer präklinischen häufigste Variante, Ratten trainiert, um Kokain über eine Intra Vena Katheter selbst verabreichen.
  2. Pflegen Sie Katheter Durchgängigkeit mit täglichen Spülungen mit einer Lösung von 0,1 mL bakteriostatische Kochsalzlösung mit Heparin Natrium (10 U/mL), Streptokinase (0,67 mg/mL) und Ticarcillin binatrium (66,67 mg/mL). Katheter spülen am Tag nach der Operation beginnen und jeden Tag nach Selbstverwaltung Sitzungen weiter.
    1. Füllen Sie eine Spritze mit der Lösung, und schließen Sie die Hintere Halterung an der Spritze über Polyethylen-Rohr zu spülen.
    2. Überprüfen Sie richtigen Katheter Funktionsfähigkeit regelmäßig während des Experiments durch intravenöse Gabe von 10 mg/kg Natrium Methohexital.
      Hinweis: Dies ist eine Dosis, die ausreicht, um kurzzeitig betäuben des Tieres nur bei intravenös verabreicht.

(3) Selbstverwaltung

  1. Verwenden Sie Software-Programmierung, um 4 separate Programme zu generieren, wie nachfolgend beschrieben.
    1. Code 2 Programme für Selbstverwaltung auf einem festen Verhältnis (FR) 1 Spielplan, dh., wo ein wirkhebel Druck ergibt sich eine Infusion. Den linke Hebel code für Programm #1 als der wirkhebel; den rechten Hebel code für Programm #2 als der wirkhebel. Beide Programme 180-min Länge und liefern die Kokain-Impulse und diskrete Cue Komplex in folgender Weise zu konstruieren:
      1. Haben Sie einen wirkhebel Ursache gleichzeitiger Beleuchtung der das Haus Licht und das Impuls-Licht über der wirkhebel drücken.
      2. Haben Sie nach einer 1-s Verzögerung die Infusionspumpe über 6 s 0,1 mL der Lösung zu liefern.
      3. Haben Sie den Reiz leichten Abschaltung nach 7-s (zur gleichen Zeit wie die Infusionspumpe Inaktivierung).
      4. Haben Sie das Haus Licht Abschaltung nach 27-s, mit der letzten 20-s zeigt ein Zeitlimit in dem wirkhebel Pressen sind keine geplanten folgen, diese sind jedoch noch aufgezeichnet.
      5. Zur Datenausgabe sammeln Sie Infusionen, wirkhebel Pressen, inaktive Hebel Pressen und Latenz erste wirkhebel Presse.
    2. Zwei weitere Programme für Selbstverwaltung auf eine FR5 planen-Code, dh., wo fünf Pressen Ergebnis in eine Infusion Hebel. Wieder machen Sie ein Programm mit der wirkhebel als Links und ein Programm mit der wirkhebel als Recht. Beide Programme 180-min in Länge und liefern Sie die Verstärker und diskrete Cue Komplex in folgender Weise:
      1. Haben Sie fünf wirkhebel Pressen Ursache simultane Ausleuchtung das Haus Licht und Licht oberhalb der wirkhebel Reiz.
      2. Wiederholen Sie Schritte 3.1.1.2 durch 3.1.1.5.
  2. Selbstverwaltung-Training
    1. Bereiten Sie die Kokain-Lösung täglich in steriler 0,9 % NaCl, eine Dosis von 0,75 mg/kg/0.1 mL.
      Hinweis: Über die Dauer jeder 180 min Selbstverwaltung Sitzung Ratten verwalten ca. 4-5 mL Kokain-Lösung, also zur Vorbereitung im Überschuss erwarten täglich ca. 8 mL/Ratte.
    2. Füllen Sie die Katheter Spritze (10 mL) mit mindestens 8 mL Kokain oder Kochsalzlösung. Setzen Sie nachdem Sie sichergestellt haben, dass das Kokain/Kochsalzlösung fließt die Spritzen in die Infusionspumpe und verbinden mit der Polyethylen-Schlauch umhüllt von einer Metallfeder Leine zu Beginn jeder Sitzung Selbstverwaltung. Stellen Sie vorsichtig die Spritze in jeder Infusionspumpe so, dass die Lösung gleichmäßig und abgeschlossen in der Polyethylen-Schlauch vor dem anbringen an jeder Katheter verteilt.
    3. Statt Ratten in jeweiligen standard operanten Konditionierung Kammern mit Fans in belüfteten, Klang-mildernde Kabinen untergebracht. Konsequent jede Ratte in der gleichen operant Kammer, und der wirkhebel auf der gleichen Seite in allen Experimenten. Zuordnung von Ratten zwischen Links und rechts aktiv Hebel auszugleichen.
      Hinweis: Jede Kammer ist mit einer Pellet-Aufnahme, flankiert von zwei einziehbare Antwort Hebel, ein Impuls Licht über jede Antwort-Hebel und ein Haus Licht gegenüber den Hebeln ausgestattet. Kokain/Kochsalzlösung Spritzen mit 23g verbunden sind (eingereicht, um zu vermeiden, stochern Schläuche) Nadel befestigt Polyethylen-Schläuche eingehüllt in eine Metallfeder-Leine, die jede Ratte Katheter verbindet und ist auf einem flüssigen drehbaren betrieben. Spritzen werden in Infusionspumpen befindet sich direkt neben der Kabine platziert.
    4. Zug Ratten, Hebel drücken, um Kokain Infusionen (0,75 mg/kg/0.1 mL Infusion) oder Kochsalzlösung Infusionen (0,1 mL) während täglich 180-min-Sitzungen mit etablierte Methoden28,36,37,51.
      Hinweis: Diese Schulung erfolgt einfach indem die Ratte in die operante Kammer und erlaubt es, Hebel drücken; durch Drücken der wirkhebel führt Erhalt des komplexen diskrete Cues und Kokain Infusion während den inaktiven Hebel drücken keine geplanten Folgen trägt.
      1. Zeitplan Fertigstellungen auf dem wirkhebel Ergebnis im Lieferumfang ein Kokain oder Kochsalzlösung Infusion über einen Zeitraum von 6 s gleichzeitig gepaart mit Beleuchtung von Haus Licht und Licht oberhalb der wirkhebel Reiz und Aktivierung der Infusionspumpe (Dies ist die diskrete Cue-Komplex gepaart mit Kokain-Lieferung); inaktive Hebel Pressen produzieren keine geplanten folgen. Im Anschluss an Verstärker (Kokain) Lieferung das Impuls-Licht sowie die Infusionspumpe inaktiviert; Das Haus Licht bleibt für eine zusätzliche 20-s, ein Timeout angegeben, während der Hebel drückt keine geplanten Konsequenzen haben.
        Hinweis: Eine Beschreibung des wie Sie dies einrichten ist in Schritte 3.1.1.1-3.1.1.4 gefunden.
    5. Entfernen Sie nach Abschluss der Sitzung 180 min jede Ratte aus der operanten Konditionierung Kammer und spülen Sie den Katheter (Schritt 2.2). Reinigen Sie sorgfältig die Kammern zwischen den Sitzungen, jede Oberfläche mit 70 % Ethanol-Lösung abwischen.
      Hinweis: Ratten, die Kokain während der Sitzung Selbstverwaltung erhalten können schwierig sein, aus der Kammer zu entfernen und sind eher aggressiv zu sein. Verwenden Sie langsame und vorsichtige Bewegungen seine Leine jede Ratte trennen.
    6. Trainieren Sie Ratten auf einem FR1 Zeitplan der Verstärkung und des Fortschritts zu einem FR5 Zeitplan nach dem Kriterium der sieben Infusionen/h mit weniger als 10 % erreichen Variabilität in der Gesamtzahl von Infusionen pro Sitzung für drei aufeinander folgenden Tagen. Weiter Selbstverwaltung Sitzungen bis Ratten insgesamt 14 Tage der Selbstverwaltung Training erreicht haben.
      Hinweis: Dies ist eine Variante des operanten Lernens; einige Protokolle bevorzugen Ratten während der Ganzheit des Experiments auf FR1 bleiben. Änderungen im Zeitplan der festen Verhältnis von FR1 bis FR5 haben keine Auswirkungen auf die Anzahl der Infusionen ein Tier self-administers54,55. Jedoch festes Verhältnis vergrößern sorgt für Stabilität bei der Ratte zu reagieren, und der Salienz der Belohnung56erhöhen kann. Darüber hinaus auf Wunsch eine Behandlung während der erzwungenen Abstinenz ist Ratten sollten Pseudo-zufällig zugewiesen werden Behandlungsgruppen auf Stabilität (weniger als 10 % Variabilität in der Gesamtzahl von Infusionen pro Sitzung für ein Minimum von 3 aufeinander folgenden Tagen) bei FR5 Zeitplan. Darüber hinaus werden Kochsalzlösung Ratten nicht aus FR1 FR5, Fortschritte zu wie der Salienz der Kochsalzlösung nicht ausreichen, um die Stabilität erforderlich, um die Fortschritte von FR1, FR5 zu erreichen ist.

4. erzwungene Abstinenz

  1. Legen Sie Ratten in erzwungenen Abstinenz für 30 Tage; Das heißt, liefern Sie keine Ratten mit der Möglichkeit, Kokain oder Kochsalzlösung für eine Dauer von 30 Tagen selbst verabreichen. Wichtig ist, in diesem Zeitraum nicht zurück Ratten zu den operanten Kammern (den vorherigen Kontext der Selbstverwaltung). Jedoch entfernen Sie Ratten vom Hause Käfige für die tägliche Handhabung und wiegen, als Maß für die allgemeine Gesundheit.
    Hinweis: Die Dauer der erzwungenen Abstinenz kann geändert werden, aber es ist wichtig, eine Dauer zu wählen, die ausreicht, um Decke und Boden-Effekte zu vermeiden. Bewusst sein, wenn die Dauer der erzwungenen Abstinenz die Wahl unter anderem Nagetier Belastung, Alter, Selbstverwaltung Sitzungsdauer und Dauer, Medikament, Medikament Dosis und Infusion Dauer und das Geschlecht des Tieres.

(5) Kokain Cue Reaktivität

  1. Kodieren Sie zwei Software-Programme für die Cue Reaktivität Aufgabe bei einem FR1 Zeitplan; ein Programm mit dem linken Hebel als der wirkhebel, mit dem rechten Hebel als der wirkhebel. Konstruieren Sie jedes Programm Hebel drücken Daten für 60 Minuten sammeln zu und liefern Sie den diskreten Cue komplexe wie unten beschrieben.
    1. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.1.1-3.1.1.4
    2. Für die Datenausgabe sammeln Sie Cue-Präsentationen (vorher bekannt als Infusionen), zuvor aktiven Hebel drückt, inaktive Hebel Pressen und Latenz zum ersten Hebel drücken.
  2. Kokain-Cue-Reaktivität-Test-Session
    1. Bewerten Sie Cue Reaktivität am Tag 30 des erzwungenen Abstinenz im 60-min operant Testfahrten. Staffeln Sie Startzeiten von Ratten, schnelle Enthauptung und Gehirn Ernte zu erleichtern. Stellen Sie wichtig ist, für den Cue Reaktivität Test nicht die Spritze in die Infusionspumpe so dass der Klang der Infusionspumpe als eine auditive Cue dient aber keine Kokain Bewehrung wird ausgeliefert.
      Hinweis: Cue Reaktivität an anderen Tag 30 der erzwungenen Abstinenz Tagen beurteilt werden kann, aber die Tatsache, die dass Reaktionsfähigkeit auf Kokain gepaart Hinweise über Zeit34 variiert sein sollte im Auge behalten, wenn Sie das Datum für den Cue Reaktivität Test wählen.
    2. Legen Sie jede Ratte in der Selbstverwaltung-Kammer, in der er ausgebildet wurde, und an der Kanüle wie während der täglichen Selbstverwaltung-Sitzungen zu begrenzen. Pressen auf den Hebel, der zuvor Kokain oder Kochsalzlösung geliefert werden jetzt nur durch Lieferung von der diskreten Cue-Komplex verstärkt (i.e. Anregung Licht und Haus sind beleuchtet und die Infusionspumpe aktiviert) planmäßig FR1 (d. h., eine diskrete Cue Komplex wird pro wirkhebel Presse vorgestellt); zählen Sie die Cue-Präsentationen zuvor aktiven Hebel drückt während einer 60-Minuten-Sitzung und auch erfassen die Anzahl der inaktiven Hebel drückt. Jedoch produzieren als mit Selbstverwaltung, inaktive Hebel drückt keine geplanten folgen.
      Hinweis: Eine zusätzliche Steuerungsmöglichkeit ist zuvor aktiven und inaktiven Hebel Pressen bei fehlender geplanten Folgen aufzeichnen (i.e., keine diskreten Cue komplexe Verstärker).
    3. Testen Sie nach Abschluss der Cue Reaktivität Sitzung zu, sofort einschläfern Sie Ratten um die biochemischen Auswirkungen von Re-Exposition gegenüber der operanten Konditionierung Kammer und diskrete Cue Komplex zu erfassen.

6. Datenerhebung, Organisation und Analyse

  1. Daten in drei herkömmlichen Kategorien unterteilen: allgemeine Gesundheit, Selbstverwaltung und Cue Reaktivität.
    1. Allgemeine Gesundheit zu überwachen (z. B.., Tier Gewicht, Pelz Zustand) in das Experiment und Tiere mit Tierarzt kümmert, wenn notwendig, oder entfernen Sie aus der Studie erscheint Hebel Drücken von Gesundheit betroffen.
    2. Datenerhebung der Selbstverwaltung in den 14 Tagen der Selbstverwaltung. Verwenden Sie einen unpaaren, zwei-tailed t-Test um zu statistischen Unterschiede zwischen Kokain und Kochsalzlösung Selbstverwaltung Gruppen für Gesamtzahl der Infusionen, wirkhebel Pressen, inaktive Hebel Pressen und Latenz erste wirkhebel Presse zu bestimmen.
      Hinweis: Selbstverwaltung, die Daten vor dem zu analysierenden müssen Abstinenz gezwungen wenn man wünscht, die Wirkung einer Behandlung während der erzwungenen Abstinenz auf Cue Reaktivität untersuchen (so dass Gruppen eine gleiche durchschnittliche Anzahl der Infusionen, sowie aktive und inaktive Hebel drückt). Wenn eine zwei-Mal-zwei-Design (Kokain ± Behandlung, saline ±) gewählt wird, sollte eine zwei-Wege-ANOVA mit entsprechenden post-hoc-Analyse verwendet werden, um diese Daten zu analysieren.
    3. Für Cue-Reaktivität-Daten zu sammeln und zu analysieren, die Gesamtzahl der Cue-Präsentationen, zuvor aktiven Hebel drückt, inaktive Hebel Pressen und Latenz zum ersten Hebel drücken. Auch analysieren Sie diese Daten mit einem ungepaarten, zweiseitigen t-Test um Unterschiede zwischen den Tieren selbst-Verwaltung Kokain und die selbst-Verwaltung Kochsalzlösung zu bestimmen.
      Hinweis: Wenn eine zweit-Design (Kokain ± Behandlung, saline ±) gewählt wird, sollte eine zwei-Wege-ANOVA mit entsprechenden post-hoc-Analyse wiederverwendet werden, diese Daten zu analysieren.

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Representative Results

Ergebnisse eines Kokain-Selbstverwaltung und Abstinenz-Experiments gefolgt von einem Cue Reaktivität Test aus einer zuvor veröffentlichten Studie57 sind in Abbildung 1dargestellt. Die Studie Timeline ist in Figur 1Adargestellt.

Ratten Übergang individuell von FR1, FR5, wie diese Kriterien erfüllen. Im weiteren Verlauf operanten Konditionierung in der Verwaltung von Kokain Gruppe Zahl Ratten allmählich die der Infusionen bis zum Erreichen einer Hochebene (Abbildung 1 b). Inaktive Hebel Pressen bleiben konstant niedrig in den Kokain-Administration und Verwaltung von Kochsalzlösung Gruppen; Unterschiede in der inaktiven Hebel Pressen Änderungsvorschläge in Motivation oder Gesundheit. Kochsalzlösung Selbstverwaltung dient zur Kontrolle, dass Kochsalzlösung nicht verstärkt wird; also eskalieren Hebel Pressen und Infusionen nicht von Tag 1 bis Tag 14 (nicht abgebildet). Drückt wirkhebel Rückgang der Kokain-Verwaltung Gruppe zwischen Tag 1 und Tag 14, der Katheter Durchgängigkeit (auch belegt durch die beschriebene in Schritt 2.2.2) wahrscheinlich verloren hat, und dieses Tier aus der Studie genommen werden sollte. Tiere, die statistische Ausreißer (als berechnete mit einem Dixon Q Test) sollte die Studie auch entnommen werden.

Mehrere Ausgabe-Maßnahmen werden aus dem Kokain Cue Reaktivität Test gesammelt. Abbildung 1 zeigt z. B. die Anzahl der Hebel drückt auf den zuvor aktiven Hebel. Ratten, die vorher Kokain Self-administered sollte den zuvor aktiven Hebel viel mehr Ratten drücken, die Kochsalzlösung selbst verwaltet. Und, wenn eine Behandlung effektiv bei der Dämpfung Kokain Cue Reaktivität ist, es sollte auch eine signifikante Verringerung der Zahl der zuvor aktiven Hebel Pressen in Ratten, die Kokain und die Behandlung im Vergleich zu Ratten, die Kokain erhalten erhalten und die Fahrzeug (nicht abgebildet).

Andere Messungen umfassen Latenz zum ersten Hebel drücken (Abbildung 1), Anzahl der inaktiven Hebel Pressen und Cue-Präsentationen. Änderungen in Latenz zum ersten Hebel drücken können beobachtet werden; eine erhöhte Latenz zum ersten Hebel drücken könnte darauf hindeuten, dass das Tier körperlich krank ist oder dass es verminderte Motivation für Kokain. Entsprechende Kontrollen für lokomotorische Verhalten, z. B. die Rotarod oder Freiland Aufgaben eingesetzt werden sollten, zu unterscheiden zwischen körperlichen Erkrankungen und Veränderungen in der Motivation.

Obwohl man annehmen könnte, dass die Anzahl der Cue-Präsentation in der Anzahl der zuvor wirkhebel Pressen niederschlagen sollte, ist dies oft nicht der Fall. Oft zuvor aktiven Hebel Pressen sind viel größer als Cue-Präsentationen. Ratten zeigen oft Selbstmedikation zuvor aktiven Hebel drücken während der Zeitüberschreitungsperiode, angeblich als Reaktion auf ein Versagen den erwarteten Kokain Reiz erhalten.

Figure 1
Abbildung 1. Experimentelle Timeline und repräsentative Ergebnisse der Selbstverwaltung und Cue Reaktivität. Diese Zahl verändert wurde von Miller Et Al., 201657. (A) experimentelle Timeline wie beschrieben im Protokoll Abschnitte 3,4,5. (B) durchschnittliche tägliche wirkhebel Pressen, inaktive Hebel Pressen und Infusionen ± SEM für Selbstverwaltung Ausbildung; Selbstverwaltung-Sitzungen wurden 180min pro Tag für 14 aufeinanderfolgende Tage. Kokain wurde zunächst nach einem FR1 Zeitplan der Bewehrung bis treffen Kriterium geliefert, dann ein FR5 Zeitplan eingeführt wurde. (C) durchschnittliche Hebel drückt auf den zuvor aktiven Hebel drücken ± SEM für 60 Minuten Cue Reaktivität Test; ein Ungepaartes, zwei-tailed t-Test zeigt einen signifikanten Unterschied zwischen Kokain und Kochsalzlösung selbst-Verwaltung Ratten (t(30) = 14.82, ** p < 0,0001). (D) durchschnittliche Latenzzeit zu ersten Hebel drücken ± SEM für die 60-min. Cue Reaktivität zu testen; ein Ungepaartes, zwei-tailed t-Test zeigt keinen signifikanten Unterschied zwischen Kokain und Kochsalzlösung selbst-Verwaltung Ratten (t(29) = 0.2758, p = 0.7847). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Exposition gegenüber Drogen gepaart Cues und physiologische Veränderungen als Reaktion auf diese Signale16 Rückfall,11,16 zugeordnet sind und der Kokain Cue Reaktivität Test beschäftigt über Kontingent präsentiert Kokain gepaart Hinweise in der Abwesenheit von Drogen; Droge-suchenden Verhaltens in Form von zuvor aktiven Hebel Pressen dient als Maß für Rückfall Verletzlichkeit. Das Stichwort Reaktivität Protokoll beschriebenen ist ein präklinischen Mittel durch den Rückfall-modifizierende Pharmakotherapien können getestet werden, und genetische und umweltbedingten Faktoren, die zur Rückfall-Risiko beitragen untersucht werden können. Dies ist eine operante Aufgabe für Drug-seeking-Verhalten, das deckt sich mit vielen Eigenschaften des menschlichen Drogenkonsum und Rückfall, und viele Publikationen haben wichtige Medikament Dosis und Lieferung Parameter optimiert sowie die Annahme geeigneter Kontrollen um augenscheinvalidität zu etablieren und Translationale Vorhersagekraft28,36,37,39,51. Dieses Modell wurde kürzlich in einer Studie von Miller Et al.veröffentlicht. untersucht die Verwendung von einem Peroxisom davon-aktivierten Rezeptor Gamma (PPARγ-Agonisten als eine Pharmakotherapeutische Kokain Cue Reaktivität57abzuschwächen. Diese Studie zeigte, dass Pioglitazon (einem PPARγ-Agonisten) verringerte Reaktionsfähigkeit auf Kokain gepaart Hinweise nach Abstinenz von Kokain Selbstverwaltung gezwungen. Da Pioglitazon FDA-zugelassen ist, Miller Et Al. Studie aufgefordert einen Zweiarmige, doppelblinden, randomisierten, Placebo-kontrollierten klinischen Pilotversuch zu prüfen, die Wirksamkeit von PPARγ Agonismus Kokain Cue Reaktivität, Impulsivität und riskante Entscheidungen zu unterdrücken. Die translationale Verdienst und prädiktive Gültigkeit des Modells Nagetier stützt sich auf die Schmitz Et Al. Veröffentlichung58 an dieser Pilotstudie in dem Kokain-Abhängige Themen mit Pioglitazon behandelt eine Behandlung x Zeit Interaktion für reduzierte Selbstauskünften verlangen gemessen an der kurzen Substanz Craving Skala und einer visuellen Analog-Skala für ausgestellt Lust auf58. So zeigt Pioglitazon Versprechen als Rückfall Prävention Behandlung für CUD, Einklang mit der Miller Et Al. Präklinische Daten.

Diese Ratte Kokain Cue Reaktivität Test während der Abstinenz rekapituliert chronische menschlichen Kokain Selbstverwaltung mit intermittierenden kurz (z. B. 21 Stunden) und lange (z. B. 30 Tage) Abstinenz Perioden, bietet die Möglichkeit, Parallel zu erstellen Datasets zwischen Mensch und Nager-Modelle. Jedoch unterscheidet sich dieses Protokoll von allgegenwärtiger Aussterben-Wiedereinsetzung-Modell misst Zeit, Drogenkonsum oder -sucht nach einer vom Aussterben bedroht-Prozess und (normalerweise) ein Abstinenz Zeitraum33,34,35 ,59. Obwohl das Aussterben-Wiedereinsetzung-Modell prädiktive Gültigkeit33hält, hat es auch nennenswerte Einschränkungen. Erstens geht die vom Aussterben bedroht-Prozess mit wieder auszusetzen, Saline und Kokain selbst-Verwaltung Gruppen auf den Kontext der Selbstverwaltung in Ermangelung Medikament Verstärkung60 selten beim Menschen seit Droge-in Verbindung stehenden Signale zusammengefaßt ist enthalten Stimmung Staaten, Orte und Menschen44– Hinweise, die in einer klinischen Einstellung45,46,47nicht einfach kopiert werden können. Zweitens bei der Wiedereinstellung Ratten weisen geringe Reaktion, Schaffung eines Boden-Effekt, die Fähigkeit, die Auswirkungen von Maßnahmen zur Droge-suchenden Verhaltens33erkennen unterdrückt – ein Thema, das durch das Entfernen behoben ist vom Aussterben bedroht, da Aussterben Training reagiert abnimmt. Manche mögen argumentieren, dass die 60-min. Cue Reaktivität Testsitzung oben beschriebenen als vom Aussterben bedroht Sitzung dienen könnte. Jedoch die Tatsache, dass das Protokoll nicht-medikamentöse Verstärkung, die Test-Session enthält wird nicht wiederholt, und Ratten Motivation für nachfolgende Selbstverwaltung beizubehalten, nachdem Cue Reaktivität Tests legt nahe, dass dieser Test-Design nicht Aussterben induzieren 36.

Ein weiteres Problem ist, ob die relativ kurzen Selbstverwaltung Sitzungsdauer beschäftigt (180 min) ausreicht, um nachfolgende Selbstverwaltung zu stärken ist. Literatur zeigt jedoch, dass dieses Schema konsequent ergibt sich eine stabile Muster der Ratte Kokain Selbstverwaltung37,39,51,57,61, Bereitstellung von weniger Variabilität zwischen den Tieren ermöglicht den Experimentator Themen Sortieren in post-self-Verwaltung Behandlungsgruppen,28,39,51,57auf Wunsch. Es sei jedoch darauf hingewiesen, das die kurze Dauer und kurzen Session Länge Prozedur nicht völlig menschlichen Selbstverwaltung, wo in der Regel Binge-Mustern in Kokain-Abhängige Themen62 entstehenrekapitulieren. Dennoch, wenn kontinuierliche Selbstverwaltung in Nager-Modelle erlaubt ist, sind Sterblichkeit extrem hoch63.

Zusätzliche Variablen zu berücksichtigen sind Kokain-Dosis und Infusion-Rate, da diese Sensibilisierung der subjektiven Belohnung Reaktion beeinflussen. Schnellere Geschwindigkeiten der Infusion erhöhen Sensibilisierung auf die verstärkende Wirkung von Kokain, während langsamere Geschwindigkeiten es64 verringert. Da die Dosisabhängigkeit Kurve für Kokain Selbstverwaltung einer umgekehrten U-Form ist und Dosis die Anzahl der Infusionen pro Stunde55 beeinflusst; Das obige Protokoll verwendet eine Dosis, die in der Nähe von der Spitze der Dosis-Wirkungs-Kurve in Kurzzeitzugänge und langfristigen Zugang Verfahren61 um Verschiebungen in der Anzahl der Infusionen zu erkennen fällt. Gegengewicht zu die Hebeln ist ein anderes wichtiges Steuerelement um sicherzustellen, dass die Ratten keine Präferenz für ein Hebel über den anderen zeigen.

Die repräsentativen Ergebnisse der Abbildung 1 zeigen Daten aus männlichen, Sprague-Dawley Ratten. In der Vergangenheit haben diese Studien männlichen Ratten wegen der Estrous Zyklus Auswirkungen auf die Übernahme von Kokain Selbstverwaltung65 und Aussterben/Wiedereinsetzung66beschränkt auf. Seit Sex jetzt für NIH-finanzierten Studien mandatsgemäß eine biologischen Variablen hat es unumgänglich geworden estrous Bühne zu überwachen und testen für Geschlechtsunterschiede in gemischten Studien Sex und als solche statistische Aussagekraft für alle experimentellen Gruppen berücksichtigt werden. Auf einer anderen Anmerkung, Gebrauch ein fremd-Ratte Sorte, wie z. B. Sprague-Dawley, ist vorteilhaft, dass es vergleichbar mit der menschlichen Bevölkerung genetischen Variation bietet — wenn auch fremd-Nagetier Stämme der genetischen Einflüsse Gedanke nicht vollständig rekapitulieren können zu süchtig-ähnliche Verhaltensweisen Menschen67zugrunde liegen. Alter der ersten Kokain Exposition ist schließlich ein wichtiger Aspekt. Bei Ratten zeigt Einwirkung von Kokain während der Adoleszenz Ergebnisse in klimatisierten Ort bevorzugt, die einer größeren Anzahl von Aussterben Studien zu löschen68, darauf hindeutet, dass die Jugendliche Ratte erfordert größere Dauerhaftigkeit von Kokain-sucht Verhalten. Pränatale und frühe postnatale Exposition gegenüber Kokain verändern damit, wahrscheinlich Kokain Cue Reaktivität.

Denn Aussterben nicht das Ziel der Cue Reaktivität testen, ist eine Einschränkung, dass die Aufgabe nicht bewertet werden, wiederholt oder über lange Laufzeiten, sonst das Tier erlischt die Paarung von dem Kokain (primäre) Verstärker mit dem diskreten Cue Komplex ( konditionierte Verstärker). Daher muss darauf geachtet werden bei der Gestaltung des Experiments um sicherzustellen, dass das Aussterben dieser Tierart nicht auftritt. Ein Vorteil dieser Aufgabe ist jedoch, dass der genaue biochemischen Veränderungen induziert durch die Einwirkung von Kokain gepaart Signale können mit diesem Verfahren aufgeklärt werden. Eine zweite Einschränkung, die Aufgabe ist, dass es nur für positive Verstärker funktioniert, obwohl dies eine Einschränkung für viele Modelle für Drogen Missbrauch ist. Wichtige Schritte im Protokoll gehören Wartung der Katheter Durchgängigkeit (Schritt 2.2), Erwerb der Selbstverwaltung (Schritt 3.2), angemessene Verteilung von Ratten in Behandlungsgruppen, auf Wunsch, die statistisch für Infusionen und Anzahl der Hebel Pressen (Schritt 3.2.6) und richtige Software Programmierung im gesamten um sicherzustellen, dass die diskrete Signale dargestellt und gepaart mit dem Kokain Reiz während des Trainings der Selbstverwaltung und den Cue Reaktivität Test (Schritte 3.1, 5.1). Als mit anderen Rückfall-Verwundbarkeit-Modellen ist es zwingend notwendig, um eine angemessene Länge der Abstinenz zur Vermeidung von Boden und Decke Auswirkungen auf reagiert während der Cue Reaktivität Test33,34 (Schritt 4) zu erreichen. The Most wahrscheinlich Komplikationen zu Begegnung mit diesem Verfahren sind (1) Verlust des Katheters Durchgängigkeit Erwerb der Selbstverwaltung, (2) falsche Verteilung von Nagetieren in Behandlungsgruppen nach Selbstverwaltung Training und vor dem Cue zu verhindern Reaktivität Tests verursacht einen Fehler vom Typ1 oder Typ2 und 3) nicht genügend Abstinenz um Unterschiede bei der Reaktion zwischen Gruppen zu bestimmen. Diese können durch tägliche Bewertung der Selbstverwaltung Leistung, regelmäßige Katheter Spülungen, Zuordnung zu Analysegruppen von post-hoc-nach Ausgleich für Selbstverwaltung Leistung und Pilotversuchen Bestimmung geeigneter Abstinenz gelöst werden Dauer für Nager Belastung, Alter, Selbstverwaltung Sitzungsdauer und Dauer, Medikament, Dosis der Droge, Medikament Infusion Dauer und Sex.

Dieses Verfahren ist erweiterbar, viele Nager Stämme, einschließlich Mäuse69und jedes Modell die Paarung von primären lohnende Verstärker mit diskreten Signale (konditionierten Verstärker) beinhaltet. Alternative primäre Verstärker gehören anderen Medikamentenklassen, hohe fettreiche Nahrung und anderen schmackhaften Belohnungen69,70. Schließlich wurde translationale Relevanz dieses Modells nachgewiesen, indem man vorwärts eine FDA-zugelassene Intervention in Ratten, CUD menschlichen Probanden führte zu reduzierten Kokain verlangen getestet. So, die Kokain Cue Reaktivität Test nach Kokain Selbstverwaltung und Abstinenz hält Versprechen als translationale Nagetier Modell.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenlegen.

Acknowledgments

Alle wurden Verhaltens im University of Texas Medical Branch (UTMB) Nagetier In Vivo Assessment (RIVA) Kern, unter der Regie von Dr. Kelly Dineley und befindet sich im Zentrum für Suchtforschung, unter der Regie von Dr. Kathryn Cunningham Tests. Die Unterstützung für diese Arbeit von Peter F. McManus Charitable Trust, National Institute of Environmental Health Sciences Center für Umwelttoxikologie am UTMB kam (T32ES007254), Institut für translationale Sciences am UTMB (UL1TR001439), Mitchell-Zentrum für Neurodegenerative Erkrankungen und Zentrum für Suchtforschung am UTMB (DA007287, DA070087 und pilot-Studie-Fonds).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Catheter Tubing: 0.50mm ID x 0.94mm OD x 0.2mm width Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 11-189-15A 1/experiment
Cue Light Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-229M 2/operant chamber
Guide Cannulae (22 gauge, pedestal size-8mm, cut length 11 mm, 5 mm above the pedestal) Plastics One, Roanoke, VA, USA 8IC313G5UPXC 1/rat
House Light Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-227M 1/operant chamber
Infusion Pump Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA PHM-100 1/operant chamber
Levers Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-110M 2/operant chamber
Liquid Swivels Instech, Plymouth Meeting, PA, USA 375/22 1/operant chamber
MED-PC Package with Infusion Pump Software Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA SOF-735 (infusions software SOF-700RA-10 version 1.04) 1
Metal Spring Leash Plastics One, Roanoke, VA, USA C313CS/SPC 1/operant chamber
Needle (23g, 1 in) Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA 305193 1/operant chamber
Nitex Mesh (6/6 woven mesh sheet, 12"x12", 500 microns thick, 38% Open Area) Amazon, Seattle, WA, USA CMN-0500-C, B000FMUNE6 ~1 sheet/100 rats
PCI Interface Package Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA DIG-700P2-R2, MED-SYST-16 1/16 operant chambers
Power Supply for Interface Modules Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA SG-6510D 1/16 operant chambers
Sound-attenuating Cubicle Med Associates Inc., St. Albans, VT, USA ENV-018V 1/operant chamber
Syringes, 10 mL Luer-Lok™ tip Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 14-827-52 1 case/experiment (1/operant chamber)
Tygon Tubing for flushes: 0.51mmID x 1.52mm OD 0.51mm width x 152.4m length Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 14-170-15B 1/experiment
Chemicals
Acepromazine (10mg/mL) Henry Schein (Animal Health), Melville, NY, USA 003845 ~0.5mg/rat*
Acraweld Repair Resin Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 1013959 1/experiment
Altalube (ophthalmic ointment) Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 6050059 1/experiment
Cocaine NIDA North Bethesda, MD, USA N/A ~350mgs/rat for whole experiment*; requires DEA License
Heparin (10,000 USP units/10 mL) Sagent Pharmaceuticals, Schaumburg, IL, USA NDC 25021-400-10 1/experiment (~21 units/rat*)
Jet Liquid Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 1256401 1/experiment
Ketamine (100mg/mL, 10mL) Henry Schein (Dental), Melville, NY, USA 1049007 ~15mg/rat*; requieres DEA license
Methohexital Sodium (Brevital®, 500 mg/50 mL) Patterson Dental, Saint Paul, MN, USA 043-5461 1/experiment; requires DEA License
Saline (0.9%, USP) Baxter, Deerfield, IL, USA 2B1307 1 case/experiment
Streptokinase from β-hemolytic Streptococcus (Lancefield Group C) ≥3,000 units/mg Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA S3134-250KU 1 vial/experiment (~1.5mg/rat/experiment*)
Ticarcillin Disodium Salt Fisher Scientific, Hampton, NH, USA 50-213-695 ~4 vials/exeriment or purchase the 25g vial cat.# 50-489-093 (~150mg/rat/experiment*)
Xylazine (100mg/mL) Henry Schein (Animal Health), Melville, NY, USA 033198 ~3mg/rat*
*Assumes rat age is that described in the protocol, rats self-administer for 14 days, and flushes occur for 21 days.

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Dimet, A. L., Cisneros, I. E., Fox, R. G., Stutz, S. J., Anastasio, N. C., Cunningham, K. A., Dineley, K. T. A Protocol for Measuring Cue Reactivity in a Rat Model of Cocaine Use Disorder. J. Vis. Exp. (136), e55864, doi:10.3791/55864 (2018).

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