Identification et caractérisation des facteurs métastatiques par transfert de gènes dans le RIP de roman-Tag ; RIP-tva modèle murin
Summary
Nous présentons un protocole visant à démontrer un système de transfert de gène somatique utilisant RIP-Tag ; RIP-tva modèle de souris pour étudier la fonction des gènes à la métastase. Les rétrovirus aviaires sont livrés intracardiacally afin d’assurer le transfert de gènes en lésions précancéreuses et non invasives des cellules β pancréatiques chez la souris adulte.
Abstract
Cancer métastatique représente 90 % des décès chez les patients atteints de tumeurs solides. Il y a un besoin urgent de mieux comprendre les pilotes des métastases cancéreuses et à identifier de nouvelles cibles thérapeutiques. Pour étudier les événements moléculaires qui animent la progression du cancer primitif de métastase, nous avons développé un modèle de souris bitransgenic, RIP-Tag ; RIP-tva. Dans ce modèle de souris, le promoteur de l’insuline de rat (RIP) amène l’expression de l’antigène T de SV40 (Tag) et le récepteur pour le sous-groupe un virus de la leucose aviaire (tva) dans les cellules β du pancréas. Les souris développent des tumeurs neuroendocrines du pancréas avec une pénétrance 100 % par des étapes bien définies qui ressemblent à la tumorigenèse humaine, avec étapes dont l’hyperplasie, angiogenèse, adénome et carcinome invasif. Parce que RIP-Tag ; RIP-tva souris ne développent pas la maladie métastatique, les altérations génétiques qui favorisent la métastase peuvent être identifiées facilement. Transfert de génique somatique en exprimant le tva, prolifèrent β du pancréas des lésions précancéreuses est réalisée par injection intracardiaque de rétrovirus aviaires nourrissait l’altération génétique désirée. Un titre de > 1 x 108 unités infectieuses / ml est considéré comme approprié pour in vivo de l’infection. En outre, les rétrovirus aviaires peuvent infecter les lignées cellulaires dérivées de tumeurs dans RIP-Tag ; RIP-tva souris à haut rendement. Les lignées cellulaires permet également de caractériser les facteurs métastatiques. Ici, nous montrons comment utiliser ce modèle de souris et de lignées afin d’évaluer les fonctions des gènes candidats à la métastase des tumeurs de cellules.
Introduction
La plupart des cancers résultent de mutations somatiques 1. Modèles conventionnels de souris génétiquement modifiées (GEMM) ont fourni des aperçus significatives de la contribution des altérations génétiques spécifiques à la tumorigenèse 2. Toutefois, ils présentent plusieurs limites. L’inconvénient majeur de ces modèles est qu’ils ne reproduisent pas le caractère sporadique de la formation de tumeurs chez l’homme, dont seulement certaines cellules dans un tissu acquièrent des altérations génétiques. Les mutations chez les souris transgéniques et knock-out sont également des cellules germinales avec susceptibles d’affecter le développement. En outre, ces modèles de souris est long et coûteux.
Métastase est une question importante dans le domaine du cancer. Modélisation des métastases a été difficile à GEMM. Métastase spontanée est rare chez la souris. Pénétrance est variable et la latence est long dans GEMM de métastase 3. Métastase expérimental modèles emploient injection directe des cellules dans la circulation des souris, alors les premières étapes dans la cascade métastatique sont éliminés.
Pour remédier à certaines des limitations ci-dessus dans l’étude des facteurs métastatiques dans des modèles murins, nous avons développé un modèle de souris bitransgenic, RIP-Tag ; RIP-tva4. La stratégie repose sur la combinaison de l’utilisation d’un modèle de souris de la progression tumorale très synchronisés, RIP-Tag 5et le récepteur pour le virus de la leucose aviaire sous-groupe-A, tva 6,7. Ce RIP -Tag ; RIP-tvamodèle de souris permet de gènes à introduire somatiquement dans une souche de souris unique bitransgenic. Avec l’antigène T de SV40 supprimant les fonctions suppresseurs de tumeur Rb et p53, souris développent des tumeurs neuroendocrines du pancréas de manière similaire à la tumorigenèse humaine, avec étapes dont l’hyperplasie, angiogenèse, adénome et carcinome invasif. Ce modèle RIP-Tag a été très instructif pour notre compréhension des caractéristiques du cancer, sans s’y limiter à des tumeurs neuroendocrines du pancréas. Il a également été utilisé dans des essais précliniques 8.
Nous présentons un protocole pour le transfert génique somatique par injection de rétrovirus aviaire intracardiacally dans RIP-Tag ; RIP-tva souris. Succès Infectionà RCASBP dérivés des rétrovirus aviaires nécessite activement la prolifération des cellules cibles. Par conséquent, nous avons choisi RIP-Tag ; RIP-tva souris à 7 semaines d’âge, quand l’hyperplasie se développe chez environ 50 % des îlots pancréatiques. Une injection intracardiaque ventriculaire gauche de virus de titre élevé est nécessaire pour atteindre un rendement d’infection de 10-20 % 4. Cette méthode de livraison réduit la dilution significative de particules virales dans la circulation avant virus atteignent les îlots pancréatiques.
En utilisant cette approche, nous avons démontré précédemment que Bcl-xL favorise les métastases cancéreuses indépendant de son anti-apoptotique fonction 4,9. Cette fonction métastatique anti-apoptotique indépendante n’a été observée lorsque Bcl-xL a été exprimé par un transgène dans toutes les cellules β du pancréas tout au long de l’ontogénie tumorigène dans le RIP-Tag ; RIP-Bcl-xL souris modèle 10. Par conséquent, notre modèle de souris offre une occasion unique pour identifier et caractériser les fonctions des gènes exprimés à un stade ultérieur de la tumorigenèse. Parce que 2 à 4 % d’îlots se développent dans les tumeurs dans la RIP-Tag ; RIP-tva bitransgenic souris sans infection virale et pas toutes les lésions précancéreuses sont infectés par les rétrovirus aviaires dérivé de RCASBP, seulement les facteurs qui confèrent un avantage sélectif au cours de la tumorigenèse naturel peuvent être identifiés. En particulier, les facteurs métastatiques seront plus facilement reconnus par cette méthode, parce que les métastases aux ganglions pancréatiques ou d’autres organes ne se produit pas normalement dans RIP-Tag ; RIP-tva souris.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans cette étude, nous avons décrit un modèle de souris puissante, RIP-Tag ; RIP-tva, pour assurer une prestation génique somatique par l’intermédiaire de rétrovirus aviaires pour l’identification et la caractérisation des facteurs métastatiques. Bien que RIP-Tag ; RIP-tva souris développent des tumeurs neuroendocrines du pancréas, métastatiques facteurs identifiés dans ce modèle de souris peuvent aussi promouvoir des métastases d’autres types de cancer.
<p class="jove_content"…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong et Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. est pris en charge par DOD grant W81XWH-16-1-0619 et NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
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