Summary
Vi presentiamo un protocollo per dimostrare un sistema di trasferimento di romanzo genica somatica che utilizza RIP-Tag; RIP-tva modello di topo per studiare la funzione dei geni in metastasi. Il retrovirus aviaria vengono consegnati intracardiacally per garantire il trasferimento genico in lesioni pre-maligne, non invasive delle cellule β del pancreas in topi adulti.
Abstract
Cancro metastatico è responsabile del 90% dei decessi nei pazienti con tumori solidi. C'è un urgente bisogno di comprendere meglio i driver della metastasi del cancro e di identificare nuovi bersagli terapeutici. Per studiare gli eventi molecolari che determinano la progressione dal cancro primario alla metastasi, abbiamo sviluppato un modello murino di bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva. In questo modello del topo, il promotore di insulina di ratto (RIP) unità, l'espressione dell'antigene T di SV40 (Tag) e il recettore per il sottogruppo un virus della leucosi aviaria (tva) nelle cellule β del pancreas. I topi sviluppano tumori neuroendocrini pancreatici con penetranza del 100% attraverso fasi ben definite che sono simili alla tumorigenesi umana, con le fasi compreso l'iperplasia, l'angiogenesi, l'adenoma e carcinoma invasivo. Perché RIP-Tag; RIP-tva topi non sviluppano la malattia metastatica, alterazioni genetiche che promuovono le metastasi possono essere identificate facilmente. Genica somatica trasferire in tva-esprimendo, proliferando β pancreatiche lesioni premaligne avviene attraverso iniezione intracardiaca di aviaria retrovirus che harboring l'alterazione genetica desiderata. Un titolo di > 1 x 108 unità infettive per ml è considerato appropriato per l'infezione in vivo . Inoltre, retrovirus aviaria può infettare linee cellulari derivate da tumori in RIP-Tag; RIP-tva topi con alta efficienza. Le linee cellulari è utilizzabile anche per caratterizzare i fattori metastatici. Qui dimostriamo come utilizzare questo modello di mouse e di cellula per valutare le funzioni di geni candidati in metastasi del tumore.
Introduction
Maggior parte dei tumori derivano da mutazioni somatiche 1. Modelli convenzionali e geneticamente costruito del topo (GEMM) hanno fornito notevoli intuizioni il contributo di specifiche alterazioni geniche alla tumorigenesi 2. Tuttavia, essi hanno diverse limitazioni. Lo svantaggio principale di questi modelli è che essi non replicare la natura sporadica di formazione del tumore in esseri umani, in cui solo alcune cellule all'interno di un tessuto acquisiscono alterazioni genetiche. Le mutazioni in topi transgenici e knockoui sono anche germinale con potenziale per influenzare lo sviluppo. Inoltre, generare questi modelli murini è costoso e richiede tempo.
Metastasi è un problema significativo nel campo del cancro. Metastasi di modellazione è stato difficile in GEMM. La metastasi spontanea è rara nel topo. La penetranza è variabile e la latenza è lungo in GEMM di metastasi 3. Metastasi sperimentale modelli impiegano iniezione diretta delle cellule nella circolazione dei topi, così i primi passi in cascata metastatica sono stati eliminati.
Per superare alcune delle limitazioni di cui sopra nello studiare fattori metastatici in modelli murini, abbiamo sviluppato un modello murino di bitransgenic, RIP-Tag; RIP-tva4. La strategia si basa sulla combinazione tra l'uso di un modello murino di progressione del tumore altamente sincronizzato, RIP-Tag 5e il recettore per il virus della leucosi aviarie sottogruppo-A, tva 6,7. Questo RIP-Tag; RIP-tvamodello del mouse permette di geni ad essere introdotti somatico in un ceppo di topo bitransgenic singolo. Con l'antigene T di SV40 sopprimere le funzioni soppressiva del tumore di Rb e p53, i topi sviluppano i tumori neuroendocrini del pancreas in modo simile alla tumorigenesi umana, con le fasi compreso l'iperplasia, l'angiogenesi, l'adenoma e carcinoma invasivo. Questo modello RIP-Tag è stato molto istruttivo per la nostra comprensione dei segni distintivi di cancro, non limitato ai tumori neuroendocrini pancreatici. È stato utilizzato anche in studi preclinici 8.
Vi presentiamo un protocollo per il trasferimento di genica somatica attraverso iniezione di aviaria retrovirus intracardiacally in RIP-Tag; RIP-tva topi. Infezione successo con RCASBP-derivato aviaria retrovirus richiede attivamente proliferanti cellule bersaglio. Pertanto, abbiamo scelto RIP-Tag; RIP-tva topi a 7 settimane di età, quando l'iperplasia si sviluppa in circa il 50% degli isolotti pancreatici. Iniezione intracardiaca ventricolare sinistra di virus di alto titolo è necessaria per raggiungere un'efficienza di infezione del 10-20% 4. Questo metodo di consegna riduce la diluizione significativa di particelle virali all'interno di circolazione prima virus raggiungere isolotti pancreatici.
Utilizzando questo approccio, abbiamo precedentemente dimostrato che Bcl-xL promuove la metastasi del cancro indipendente della sua funzione anti-apoptotica 4,9. Questa funzione di anti-apoptotici-indipendente metastatica non è stata osservata quando Bcl-xL è stato espresso tramite un transgene in tutte le cellule β del pancreas nel corso dell'ontogenesi cancerogeno in RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mouse modello 10. Di conseguenza, il nostro modello di mouse offre un'opportunità unica di identificare e caratterizzare le funzioni dei geni quando espresso in una fase successiva della tumorigenesi. Perché 2-4% degli isolotti svilupparsi in tumori in RIP-Tag; RIP-tva bitransgenic topi senza infezione virale e non tutte le lesioni premaligne sono infettati con il retrovirus aviaria RCASBP-derivato, possono essere identificati soltanto i fattori che conferiscono un vantaggio selettivo nel corso naturale della tumorigenesi. In particolare, fattori metastatici saranno più facilmente riconosciuti da questo metodo, perché la metastasi ai linfonodi pancreatici o altri organi non si verifica normalmente in RIP-Tag; RIP-tva topi.
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Protocol
etica istruzione: gli esperimenti sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida e regolamenti stabiliti dall'Istituto per la cura degli animali e uso Comitato di Weill Cornell medicina.
1. scelta dell'aviaria vettori retrovirali (A RCASBP-based o RCANBP(A)-based)
- vettori è stato derivato da Rous sarcoma virus 11. Aviaria vettori retrovirali in grado di fornire i cDNAs (≤ 2,5 kb), short hairpin RNA (shRNA), i microRNA (Mirna) e altri RNA non codificanti. I vettori commercialmente disponibili sono elencati in materiali e gli altri devono essere richiesti direttamente dagli autori.
- Ai overexpress dei geni di interesse, utilizzare uno dei seguenti vettori, RCASBP(A) 12 ( Figura 1A), RCA-X ( Figura 1B), RCA-Y 13 ( Figura 1), RCASBP-Y DV 14 o altri vettori di ALV-A (https://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/mice.html).
- a bussare geni di interesse di shRNA, utilizzare uno dei seguenti vettori: RCAN-X DV 15 o RCA-RNAi 16.
- a overexpress Mirna, generare RCA-miR vettore come descritto nel 17.
- Trasformazione in e. coli e DNA requisito.
- Preferibilmente trasformare il DNA in cellule competenti Stbl2 o Stbl3, che hanno unico genotipo per stabilizzare dirette sequenze retrovirali e ripetere. Purificare il DNA plasmidico utilizzando un metodo che consente di ottenere puro, grado di transfezione del DNA. 5 µ g di DNA è necessaria con concentrazione minima di 0,1 µ g / µ l.
2. Propagazione virale nella linea cellulare di pollo del fibroblasto DF1
- l'uso di puntali filtrata per la coltura delle cellule è necessaria per evitare la cross-contaminazione virale scorte 18.
- Cellule di mantenere DF1 in piatto di 6cm con crescita medio (DMEM con alto glucosio, 10% siero bovino fetale, 6mm (concentrazione finale) L-Glutammina, 10 unità/ml penicillina, 10 µ g/ml di streptomicina) al 37 o C e 5% CO 2. Se le cellule DF1 sono appena scongelate dalle scorte congelate, li cultura per almeno 3 giorni prima di transfezione.
- Pass di un giorno prima di transfezione, DF1 cellule ad un piatto di coltura del tessuto di 6cm affinché siano confluenti di 30-50% al momento della trasfezione.
- Diluire 5 µ g di DNA virale puro con DMEM (senza siero, penicillina e streptomicina) per un volume totale di 150 µ l in un tubo del microcentrifuge all'interno di una cappa di coltura del tessuto.
- Aggiungere 30 µ l di Superfect direttamente nel tubo di DNA diluito; vortice questa miscela per 10 s; lasciare la miscela a temperatura ambiente per 5-10 minuti nella coltura del tessuto cappa per permettere la formazione di complesso-transfezione.
- Mentre la formazione del complesso avviene, aspirare delicatamente crescita medio dalla piastra di coltura cellulare DF1 e lavare accuratamente le cellule con 4 ml di PBS - / -.
- Pipettare 5 ml della crescita medio (contenente siero e antibiotici); salvare 4 ml in un tubo Falcon per il prossimo passo; e aggiungere il resto di 1 ml di terreno di coltura per i complessi di transfezione. Mescolare pipettando su e giù due volte e trasferire immediatamente i complessi di transfezione intero alle cellule DF1. Ricciolo per garantire che lo strato delle cellule è coperto; Incubare per 2-3 ore a 37 o C.
- Lavare le cellule con 4 ml di PBS - /-; aggiungere 4 ml di terreno di coltura fresco (contenenti siero ed antibiotici), aspirare la miscela di transfezione; tornare le cellule in un incubatore a 37 o C.
- Quando le cellule raggiungono la confluenza, passage cellule (espressione transitoria può essere analizzato 48 a 72 h dopo trasfezione).
- Continuare a passare le cellule per circa 7 giorni fino a quando tutte le celle sono presumibilmente infettate; test di integrazione di DNA virale mediante PCR e determinare l'espressione della proteina mediante Western blotting; e congelare le cellule in medium DMEM con 10% siero bovino fetale DMSO e 20%.
3. In Vivo Infezione di RIP-Tag; RIP-tva topi
- concentrazione e collezione di Virus
uso concentrato appena virus per l'infezione in vivo. Il titolo di virus tenuti in 4 o C entro una settimana non è significativamente ridotto. Tuttavia, le aliquote congelate di stock virali visualizzano 10 volte titolo ridotto dopo lo scongelamento.- Espansione tra le cellule con il virus-produttore DF1 in piatti 15 cm a seconda della quantità di virus necessaria. Per in vivo l'infezione del mouse, preparare una media di una piastra per topo.
- Pre-raffreddare il rotore (ad esempio, SW28), il secchio di swing e la macchina ultracentrifuga per 4 o C.
- Raccogliere surnatante da confluenti piatti di 15 cm. Rimuovere i detriti cellulari mediante centrifugazione a bassa velocità a 1.650 x g per 10 min a 4 o C.
- Trasferire il surnatante virale ultracentrifuga provette (Polyallomer provette da centrifuga). Girare in un'ultracentrifuga per 1,5 ore a 95.400 x g 4 o C. Per Beckman XL-100 macchina ultracentrifuga, utilizzare Accel: 1; Decelerazione: 1 impostazioni.
- Rimuovi surnatante da ultracentrifuga tubi per quanto possibili. Aggiungere PBS senza calcio e magnesio (PBS - / -) al tubo ultracentrifuga per rendere finale 100 µ l sospensione virale da un piatto di 15 cm. Coprire le provette con Parafilm. Risospendere il pellet virale invisibile nel Vortex l'ultracentrifuga le provette per 2 min a velocità media.
- Rock le provette ultracentrifuga a 4 o C per un'ora a tutta la notte.
- Trasferire la sospensione virale in una microcentrifuga. Riscaldare la sospensione virale a temperatura ambiente prima dell'iniezione in topi.
- Determinazione titolo virale.
Per ogni nuovo costrutto virale, titolo virale deve essere determinato prima dell'infezione in vivo.- Seme DF1 cellule in tutti i pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 12-pozzetti (Suggerimento: 2 x 10 4 cellule/pozzetto, 1 ml/pozzetto), in modo che essi saranno 30% confluenti al momento dell'infezione. Una piastra 12 è necessaria per una determinazione titolo virale.
- Fare una serie di diluizioni di 10 volte del surnatante virale in mezzo di crescita come segue:
- Mix 5 µ l di supernatante virale con 495 µ l crescita medio per la diluizione di 2 10 in una microcentrifuga. Vortexare brevemente per pochi secondi.
- Prendere 40 µ l dalla 10 2 diluizione nel mezzo di crescita 360 µ l in una microcentrifuga per la diluizione di 3 10. Vortexare brevemente per pochi secondi.
- Punto 3.2.2.2 per 10 4 e 10 della diluizione 5. Tubi
- set up 5 6 ml in polistirolo. Aliquotare 2,25 ml di terreno di crescita per tubo ed etichetta loro 10 6, 10 7, 10 8, 10 9, 10 10, rispettivamente.
- Mix 0,25 ml dal 10 5 diluizione con 2,25 ml di terreno di crescita nella provetta polistirolo 6 ml per la diluizione di 6 10. Vortexare brevemente per pochi secondi.
- Seguire il passo 3.2.2.5 per 10 7, 10 8, 10 9 e 10 della diluizione 10.
- Rimuovere il terreno di coltura originale dalle cellule DF1 sulla piastra 12-pozzetti. Mettere il virus 1 ml diluito in ciascun pozzetto duplicare (non infetti, 10 10 10 6 UI/ml).
- Consentono alle cellule di crescere per almeno 7 giorni (eseguire trypsinzation quando necessario). Raccogliere le cellule per isolare il DNA e verificare la presenza di DNA virale mediante PCR come descritto " 6. Protocolli di PCR ". Se questo titolo virale è di 10 unità infettive 8 ml (IU/ml), saranno osservato un positivo 398 prodotti di PCR bp da RCASBP usando il DNA dalle cellule con 10 8 10 6 virus di IU/ml, ma non da cellule non infette, o cellule con 10 10 10 9 Virus di IU/ml. Un titolo di > 1 x 10 8 unità infettive per ml deve essere utilizzata per in vivo infezione.
- Iniezione intracardiaca
Hemizygous RIP-Tag topi, topi non omozigoti, sono utilizzati in questo studio. Hemizygous RIP-Tag topi sviluppano tumori neuroendocrini pancreatici circa 10 ~ 12 settimane di età, mentre topi omozigoti hanno una più breve latenza del tumore. Perché la proliferazione delle cellule è richiesta per l'incorporazione del cDNA virale nell'host del genoma, 7-settimana-vecchio RIP-Tag; RIP-tva topi con le cellule β del pancreas iperplasiche sono usati. Siete pregati di notare che non proliferano le cellule β più normali in topi adulti.- Uso 7 settimana-vecchio RIP-Tag; RIP-tva topi in un puro sfondo C57BL/C per gli esperimenti.
- Anesthetize mouse utilizzando una combinazione di chetamina/xilazina (150 mg/kg; 15 mg/kg). Utilizzare il supporto di calore per mantenere la temperatura del corpo del mouse durante l'intero periodo di anestesia.
- Applicare lubrificante occhio a entrambi gli occhi per prevenire la secchezza corneale.
- Barba capelli dalla cavità toracica di RIP-Tag; RIP-tva topi. Mouse posizione sul dorso con il petto rivolto verso l'alto. Un pizzico di punta è effettuato per osservare l'animale non-risposta confermare l'anestesia completo effetto.
- Estendere l'arto anteriore e fissarli con nastri. Mouse di Mark ' petto s iniettabile. Contrassegnare un'intermedia di posizione tra l'incavo sternale e la parte superiore del processo xyphoid e leggermente a sinistra (anatomiche) dello sterno ( Figura 2).
- Garza-spugna imbevuto di macchia della parete di cassa anteriore con una macchia di povidone-iodio o una macchia di clorexidina seguita da un alcool isopropilico al 70% o etanolo al 70%.
- Disegnare 50 µ l di aria in un'insulina sterile 28 g ½ siringa per creare spazio tra il pistone e il menisco di siringa 500 µ l e quindi elaborare 100 µ l di virus. Lo spazio aereo senza alcun liquido sulla parete è cruciale per vedere impulso cardiaco. Verticale dell'ago di
- tenere. Tendete la pelle del mouse con una mano e inserire l'ago nella posizione contrassegnata. Quando viene visualizzata la finestra di un impulso luminoso rosso di sangue nella siringa, interrompere avanzando l'ago e difficoltà la profondità dell'ago nel topo con una sola mano.
- Usare l'altra mano per attentamente e spingere lentamente lo stantuffo per consegnare sospensione virale (~ 100 µ l) per un periodo ~ 60 secondi. Ogni volta che vedendo un impulso luminoso rosso di sangue appaiono nella siringa, consegnare 10-20 µ l. Ingresso continuo di rosso sangue ossigenato all'hub trasparente dell'ago indica il corretto posizionamento dell'ago nel ventricolo di sinistra.
- Dopo l'ultima spinta del pistone per consegnare sospensione virale e prima di vedere il successivo impulso rosso di sangue, rapidamente ritrarre l'ago dalla cavità toracica.
- Applicare una leggera pressione sul sito di iniezione per ridurre il sanguinamento per almeno 1 min.
- Attentamente spostare il mouse su un blocchetto di riscaldamento o sotto una lampada di calore fino a quando non è pienamente cosciente. Topi saranno guardati fino a quando l'anestesia svanisce così che possono camminare lontano da stimoli, un periodo di solito della durata di circa un'ora. Topi saranno monitorati quotidianamente per cappotto uniforme e intatto e cambiamenti nel comportamento.
4. Analisi istopatologica dei tumori
- nove settimane dopo l'iniezione, eutanasia 16 settimana-vecchio RIP-Tag; RIP-tva topi. Dimensioni e numeri di tumori primari del pancreas e di eventuali metastasi lorda record.
- Fix pancreas, fegato e altri organi in 10% tamponata formalina durante la notte a temperatura ambiente in una piattaforma oscillante.
- Trasferire i tessuti fissi in etanolo al 70% il giorno successivo. Tessuti di processo in sezioni paraffina-incastonati.
- Eseguire immunoistochimica per lo synaptophysin (un indicatore neuroendocrino) o insulina (un marcatore di cellula-specifico β) dopo produttore ' s istruzioni per identificare le metastasi delle cellule β del pancreas nei linfonodi pancreatici o fegati. Tuttavia, cellule de-differenziate del tumore o le cellule del tumore scarsamente differenziato potrebbe perdere l'espressione dell'insulina e possono essere rilevate solo lo synaptophysin immunostaining.
5. In Vitro Infezione di cellule che esprimono tva
non è necessario utilizzare virus concentrato per l'infezione in vitro. Il protocollo descritto di seguito è per due turni di infezione. Ulteriori tondi di infezione possono essere eseguite ripetendo il seguente protocollo.
- Raccogliere surnatante virale da cellule confluenti DF1. Mantenere il surnatante virale alle 4 o C per infezione entro una settimana. Prima dell'infezione, filtrare il surnatante virale attraverso un filtro di 0,45 μm per ottenere virus senza cellula.
- Risciacquare brevemente tva-esprimendo le cellule bersaglio (cioè N134 β del pancreas cella linea cellulare del tumore da un RIP-Tag; RIP-tva mouse) con PBS - / - per rimuovere tutte le tracce di siero, che contengono inibitore della tripsina. Risciacquare brevemente tva-esprimendo le cellule bersaglio con soluzione di tripsina-EDTA (ad esempio 0,25% tripsina-2,21 mM EDTA). Aggiungere la soluzione di tripsina-EDTA e incubare per 2 minuti. Picchiettare delicatamente la piastra. Osservare le cellule al microscopio invertito. Cellule di solito staccano in 2 o 3 min cellule bersaglio seme in una piastra di 6 cm. Uso 3 ~ 4 ml filtrato surnatante virale come mezzo di crescita.
Nota: La nutrizione nel surnatante virale viene consumata dalle cellule DF1, così cambiare il mezzo il giorno successivo. - Il giorno successivo, riscaldare abbastanza quantità di surnatante virale a temperatura ambiente. Rimuovere il mezzo da cellule bersaglio e sostituire con il surnatante virale 3-4 ml.
- Il terzo giorno, passaggio cellule come necessario. Se le cellule non sono abbastanza dense da essere attraversate, riscaldarsi ~ 4 ml di terreno di crescita regolare (DMEM con alto glucosio, 10% siero bovino fetale, 6mm (concentrazione finale) L-Glutammina, 10 unità/mL penicillina, 10 µ g/mL di streptomicina) per sostituire il surnatante virale.
- Expand cellule infette ed esaminare l'espressione della proteina di candidati mediante Western blotting 19. Gli effetti dei geni del candidato sulla migrazione e l'invasione possono essere analizzati in saggi di transwell. Queste linee cellulari possono anche essere testate per la loro potenziale metastatico al fegato in un'analisi della vena della coda per metastasi.
6. Protocolli di PCR
sul ghiaccio soluzioni devono essere eseguite più rapidamente possibile. Un mastermix senza il modello può essere fatta per un gran numero di campioni e aliquotati in provette per PCR. Moltiplicare la quantità di ogni reagente necessario per il numero di campioni. Mescolare i reagenti di flicking prior e swirl con puntale prima di prendere alcuni da aggiungere per il mastermix. Dopo l'aggiunta di ciascun reagente al tubo mastermix, dispensare su e giù per consegnare eventuali residui all'interno del.
- Per rilevare la presenza di RCASBP nelle cellule infette o trasfettate.
Il seguente protocollo chiama per 11,5 µ l del mastermix e 1 µ l di DNA genomico per ciascun campione. Assicurarsi di agitare prima dell'aggiunta di ogni reagente.- Preparare un mastermix di acqua priva di nucleasi di 7.68 µ l, 0,75 µ l DMSO, 1.25 µ l di tampone 10x II per AmpliTaq DNA polimerasi, 1.375 µ l di 25 mM MgCl 2 e 0.125 µ l di dNTP 25mm.
- Aggiungere 0.125 µ l di primer in avanti a 100 µM RCAS5626F: (5 ' - ACCGGGGGATGCGTAGGCTTCA - 3 ') e 0.125 µ l di 100 µM reverse primer RCAS6023R: (5 ' - CCGCAACACCCACTGGCATTACC - 3 ') per il mastermix.
- µ L 0.075 AmpliTaq DNA polimerasi per il mastermix.
- Mescolare il mastermix, spostando il tubo con le dita. Rotazione verso il basso il matermix in una centrifuga macchina brevementey per 3 ~ 5 secondi.
- µ L aliquota 11.5 dal mastermix ad ogni individuo le provette PCR. Ricciolo ogni volta prima di aliquotare ad un nuovo tubo.
- Ricciolo e aggiungere 1 µ l genomic DNA modello a ciascuna provetta PCR. Per preparare il DNA genomico: pellet cellulare
- Lyse a 200 µ l di 0,05 M NaOH. Dispensare su e giù per sciogliere il precipitato.
- La cella lysata a 98 ° C per 20 minuti in una macchina PCR, di calore, poi raffreddato a 25 ° C.
- Aggiungere 20 µ l 1.0 M Tris-HCl (pH 7,5) per i tubi e archivio di campioni di DNA a 4 ° C.
- Mescolare i campioni di sfogliando e centrifugare brevemente per 3-5 secondi. Mettere i tubi in una macchina PCR.
- PCR la condizione è impostata per 2 min a 92 ° C per denaturazione iniziale, seguita da 40 cicli di 30 s a 94 ° C per denaturazione, 30 s a 67° C per ricottura, 30 s a 72 ° C per estensione e 10 m a 72 ° C per estensione finale.
- Dopo la PCR è terminata, aggiungere 3 µ l di 6 x tintura di caricamento del DNA di ciascun campione. Mix di flicking e centrifugare brevemente per 3 ~ 5 secondi.
- i prodotti di PCR sono esaminati mediante elettroforesi in un gel di agarosio 2% (p/v) in 1 x TAE tampone. La dimensione del suo prodotto PCR è 398 BP.
- Genotipizzazione tag.
Il seguente protocollo chiede 10,5 µ l del mastermix e 2 µ l di DNA genomico per ciascun campione. Assicurarsi di agitare prima dell'aggiunta di ogni reagente.- Preparare un mastermix di acqua priva di nucleasi di 4,5 µ l e µ l 4.00 5 x MyTaq tampone di reazione per la polimerasi del DNA di MyTaq.
- Aggiungere 0,4 µ l di primer in avanti a 100 µM TagF2: (5 ' - GGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG - 3 ') e 0,4 µ l di 100 µM reverse primer TagR2: (5 ' - CAGAGCAGAATTGTGGAGTGG - 3 ') per il mix master.
- Aggiungere 0,8 µ l di 10 mix di primer precursore di beta-2-microglobulina (B2m) µM per il controllo interno. Gli iniettori di PCR per B2m il controllo interno, precursore di beta-2-microglobulina (B2m), sono F B2 (5 ' - CACCGGAGAATGGGAAGCCGAA - 3 ') e B2 R (5 ' - TCCACACAGATGGAGCGTCCAG - 3 ').
- µ L 0,4 MyTaq DNA polimerasi per il mastermix.
- Mescolare il mastermix, spostando il tubo con le dita. Rotazione verso il basso il mastermix in macchina centrifuga per 3 ~ 5 s.
- µ L aliquota 10.5 dal mastermix ad ogni individuo le provette PCR. Ricciolo ogni volta prima di aliquotare ad un nuovo tubo.
- Ricciolo e aggiungere il modello di DNA genomico di 2 µ l di ciascuna provetta PCR. Il DNA genomico viene preparato come descritto sopra.
- Mescolare la soluzione di sfogliando e centrifugare brevemente per 3-5 secondi. Mettere i tubi in macchina PCR.
- PCR la condizione è impostata per 3 min a 95° C per denaturazione iniziale, seguita da 35 cicli di 15 s a 95 ° C per denaturazione, 15 s a 65 ° C per ricottura, 30 s a 72 ° C per estensione e a 10 minuti a 72 ° C per estensione finale.
- Dopo la PCR è terminata, aggiungere 3 µ l di 6x loading dye a ciascun campione. Mix di flicking e centrifugare brevemente per 3 ~ 5 secondi.
- i prodotti di PCR sono esaminati mediante elettroforesi in gel di agarosio 2% (p/v) in 1 tampone di x TAE. Le dimensioni dei Tag e B2m PCR prodotti sono ~ 450 bp e 300 bp, rispettivamente.
- genotipizzazione tva.
Il seguente protocollo richiede 10,5 µ l della miscela reagente per ciascun campione. Assicurarsi di agitare prima dell'aggiunta di ogni reagente.- Preparare un mastermix di 5,6 acqua gratuita di nucleasi µ l, 0,5 µ l DMSO, 1.25 µ l 10 x Buffer II per AmpliTaq DNA polimerasi e 1.375 µ l di 25 mM MgCl 2 e 0.125 µ l di dNTP 25mm.
- µ L 0,125 di 100 µM tva-3 (5 ' - GCCCTGGGGAAGGTCCTGCCC - 3 ') e 0.125 µ l di 100 µM tva-5 (5 ' - CTGCTGCCCGGTAACGTGACCGG - 3 ') per il mastermix.
- Aggiungere 1.275 µ l di 10 mix di primer B2m µM per il controllo interno per il mastermix.
- µ L 0,125 AmpliTaq DNA polimerasi per il mastermix.
- Mescolare il mastermix, spostando il tubo con le dita. Rotazione verso il basso il mastermix in macchina centrifuga brevemente per 3-5 secondi.
- µ L aliquota 10.5 dal mastermix ad ogni individuo le provette PCR. Ricciolo ogni volta prima di aliquotare ad un nuovo tubo.
- Ricciolo e aggiungere 2µL modello di DNA genomico a ciascuna provetta PCR. Il DNA genomico viene preparato come descritto sopra.
- Mescolare la soluzione scorrendo e centrifugare brevemente per 3-5 s. mettere i tubi in macchina PCR.
- PCR la condizione è impostata per 2 min a 92 ° C per denaturazione iniziale, seguita da 35 cicli di 30 s a 94 ° C per denaturazione, 30 s a 60° C per ricottura, 30 secondi a 72 ° C per estensione e a 10 minuti a 72 ° C per estensione finale.
- Dopo la PCR è terminata, aggiungere 3 µ l di 6x loading dye a ciascun campione. Mix di flicking e centrifugare brevemente per s. 3-5
- i prodotti di PCR sono esaminati mediante elettroforesi in un gel di agarosio 2% (p/v) in 1 x TAE tampone. Le dimensioni dei prodotti di PCR di B2m e tva sono 500 bp e 300 bp, rispettivamente.
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Representative Results
Il tasso di infezione in vivo e in vitro di RIP-Tag; RIP-tva le cellule del tumore da virus basati su RCASBP ~ 20% e 80% rispettivamente sono 20. Nel RIP-Tag; RIP-tva modello del topo, circa il 4% di 400 isolotti pancreatici in ogni mouse naturalmente si svilupperà in tumori 20; quindi c'è una quantità sufficiente di cellule del tumore in ogni mouse per analisi istologiche e fenotipica dei potenziali effetti dei geni consegnato dai virus. Utilizzando questo sistema, una funzione nucleare Novella di Bcl-xL in metastasi era identificato 9. RIP-Tag; RIP-tva topi infettati con RCASBP -Bcl-xL ha esibito un' più alta incidenza di carcinomi invasivi rispetto ai topi infettati con virus di controllo, RCASBP -ALPP (96% vs 74%). Inoltre, il 47% dei RCASBP -Bcl-xL-infettati RIP-Tag; RIP-tva topi hanno sviluppato metastasi nei linfonodi pancreatici quando eutanasizzati a 16 settimane di età (Figura 3A), mentre nessuna metastasi è stata trovata in topi di controllo 20.
Inoltre, abbiamo proiettato una libreria di geni del cancro in RIP-Tag; RIP-tva topi e identificato il primo gene che promuove la metastasi ai linfonodi del pancreas ed il fegato 21 (Figura 3B e 3C). Questo gene codifica per il recettore per la proteina di motilità hyaluronan-mediata isoforma B (RHAMMB) e attiva la segnalazione 21di EGFR. Abbiamo dimostrato che la metastasi fegato-specifico può essere ricapitolata in un'analisi della vena della coda della metastasi sperimentale in cui cellule tumorali N134 inizialmente diffuso attraverso i letti capillari del polmone del destinatario topi immunodeficienti 21.
Figura 1 : Schematica dei costrutti RCASBP(A) e RCA-X RCA-Y. Clonazione di siti sono indicati in blu, grassetto del tipo di carattere. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Posizionamento della somministrazione intracardiaca. Anatomici sono rappresentati con linee tratteggiate orizzontali sullo sterno (evidenziato in bianco). Sulla pelle del mouse, l'incavo sternale e xyphoid processo servono come punti di riferimento, e l'ago viene inserito 1 mm dal Mid-sterno e leggermente a sinistra (anatomica) dello sterno. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Rilevazione del β del pancreas metastatico delle cellule di immunostaining. Le fotografie mostrano lo synaptophysin rappresentanza la macchiatura dei tumori neuroendocrini pancreatici metastatici nei linfonodi pancreatici (A, B) o nel fegato (C). RIP-Tag; RIP-tva topi sono stati infettati con retrovirus RCASBP indicato a 7 settimane di età ed eutanasia a 16 settimane di età. Barra della scala = 50 µm. ingrandimento originale = 20 X. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo studio, abbiamo descritto un modello di topo potente, RIP-Tag; RIP-tva, per realizzare la consegna genica somatica via aviaria retrovirus per l'identificazione e la caratterizzazione di fattori metastatici. Anche se RIP-Tag; RIP-tva topi sviluppano tumori neuroendocrini pancreatici, metastatici fattori identificati in questo modello di mouse possono anche promuovere le metastasi di altri tipi di cancro.
Il nostro approccio ha il vantaggio di introdurre cambiamenti genetici somatici specificamente in lesioni premaligne delle cellule β del pancreas in un modo di controllo del tempo, così più fedelmente imitando lo sviluppo del tumore umano sporadico. Questo approccio consente di evitare qualsiasi perturbazione potenziale di formazione di tessuto normale, che è spesso osservata in modelli transgenici convenzionali a causa dell'espressione ectopica del gene di interesse durante lo sviluppo. Inoltre, è molto più veloce per generare aviaria vettori retrovirali portatori di geni di interesse rispetto alla generare topi transgenici. RCASBP-derivato aviaria vettore retrovirale di tva-esprimendo le cellule in vitro ed in vivo, in grado di fornire cDNAs (≤ 2.5 kb), shRNA, Mirna e altri RNA non codificanti. L'efficienza di infezione (e infezione multipla) dipende dal tasso di proliferazione delle cellule bersaglio e l'accessibilità delle cellule. Un titolo di > 1 x 108 unità infettive per ml è richiesta per l'infezione in vivo . Consegna virale più efficiente può essere raggiunto in vitro a causa della proliferazione cellulare indotta e la possibilità di esposizione ripetuta di tutte le cellule ai virus.
Tecnica di iniezione intracardiaca precisa è fondamentale per la vitalità dei topi. In primo luogo, un 50 µ l di spazio aereo in una siringa da insulina prima di redigere la sospensione virale è cruciale per vedere impulso cardiaco. In secondo luogo, è importante per fissare la posizione della siringa, una volta che appare un impulso rosso di sangue e di consegnare lentamente 10-20 µ l sospensione virale ogni volta vedendo un impulso luminoso rosso di sangue compaiono nella siringa. Se smette di impulsi luminosi rossi di sangue dopo la consegna di 10-20 µ l di sospensione virale, riposizionamento leggermente l'ago vi aiuterà. In terzo luogo, dopo l'ultima spinta del pistone di consegnare sospensione virale e prima di vedere l'impulso di sangue, l'ago deve essere rapidamente ritirato fuori la cavità toracica e una leggera pressione applicata sul sito di iniezione contribuirà a ridurre l'emorragia interna. Ultimo ma non meno importante, non riutilizzare la siringa di insulina su un altro mouse.
Per le applicazioni future, questo RIP-Tag; RIP-tva modello murino può essere combinato con altri modelli murini transgenici, knock-in e ad eliminazione diretta. Inoltre, prevediamo che unisce questa RIP-Tag; RIP-tva modello del topo con CRISPR-Cas9 strumento di editing genomico per generare singole mutazioni puntiformi, cancellazione, riarrangiamenti genomici come inversioni e traslocazioni 22.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong e Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. è supportato da DOD grant W81XWH-16-1-0619 e NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1x | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W.
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K.
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
