Identifikasjon og karakterisering av metastatisk faktorer av genoverføring i romanen RIP-Tag; RIP-LiveTV murint modell
Summary
Vi presenterer en protokoll for å demonstrere en roman somatiske genet overføring system bruker RIP-Tag; RIP-LiveTV musemodell å studere funksjonen av gener i metastasering. De avian retroviruses leveres intracardiacally for å sikre genoverføring til pre-ondartet, noninvasive lesjoner av bukspyttkjertelen β celler i voksen mus.
Abstract
Metastatisk kreft står for 90% av dødsfall hos pasienter med solide svulster. Det er et presserende behov for å forstå driverne for kreft metastasering og identifisere romanen terapeutiske mål. Undersøke molekylære hendelser som driver utviklingen av primære kreft til metastasering, har vi utviklet en bitransgenic musemodell, RIP-Tag; RIP-LiveTV. I denne musen modellen stasjoner rat insulin arrangøren (RIP) uttrykk for SV40 T antigen (Tag) og reseptoren for undergruppe avian leukosis virus (tva) i bukspyttkjertelen β celler. Mus utvikle bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster med 100% penetrance gjennom veldefinerte faser som ligner menneskelige tumorigenesis, med etapper inkludert hyperplasi, angiogenese, adenom og invasiv carcinoma. Fordi RIP-Tag; RIP-LiveTV mus ikke utvikle metastatisk sykdom, genetiske endringer som fremmer metastasering kan identifiseres enkelt. Somatiske genet overføre til tva-uttrykke, voksende bukspyttkjertelen β premalignant lesjoner oppnås gjennom intracardiac injeksjon av avian retroviruses skjuler ønsket genetisk endring. En titer av > 1 x 108 smittsomme enheter per ml anses hensiktsmessig for i vivo infeksjon. I tillegg kan avian retroviruses infisere cellelinjer avledet fra svulster i RIP-Tag; RIP-LiveTV mus med høy effektivitet. Cellen linjene kan også brukes til å beskrive metastatisk faktorene. Her viser vi hvordan du bruker denne musemodell og cellelinjer å vurdere funksjonene til kandidat gener i svulst metastasering.
Introduction
Mest kreft oppstår fra somatiske mutasjoner 1. Konvensjonelle genmodifiserte musen modeller (GEMM) har gitt betydelig innsikt i bidraget fra bestemte genetiske endringer tumorigenesis 2. De har imidlertid flere begrensninger. Den store ulempen av disse modellene er at de ikke sprer sporadiske natur tumor formasjon i mennesker, der bare noen celler innenfor en vev erverve genetiske endringer. Mutasjoner i transgene og knockout mus er også germline med påvirke utviklingen. Videre er disse musen modeller dyrt og tidkrevende.
Metastasering er et betydelig problem innen kreft. Modellering metastasering har vært vanskelig i GEMM. Spontan metastasering er sjelden i musen. Ventetid er lenge i GEMM metastasering 3penetrance er variabel. Eksperimentell metastasering modeller sysselsetter direkte injeksjon av celler i sirkulasjon av mus, så tidlig trinnene i metastatisk kaskade elimineres.
For å overvinne noen av over begrensningene i å studere metastatisk faktorer i musen modeller, har vi utviklet en bitransgenic musemodell, RIP-Tag; RIP-LiveTV4. Strategien er basert på å kombinere bruk av en svært synkronisert svulst progresjon musemodell, RIP-Tag 5, og reseptoren for undergruppe-A avian leukosis virus, tva 6,7. Denne RIP-Tag; RIP-LiveTVmusemodell gjør gener introduseres somatically i en enkelt bitransgenic musen belastning. SV40 T antigen undertrykke svulst undertrykkende funksjonene til Rb og p53, utvikle mus bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster på en lignende måte til menneskelig tumorigenesis, med etapper inkludert hyperplasi, angiogenese, adenom og invasiv carcinoma. Denne RIP-Tag -modellen har vært svært lærerikt for vår forståelse av kjennetegnene av kreft, ikke begrenset til bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster. Det er også brukt i preklinisk forsøk 8.
Vi presenterer en protokoll for somatiske genoverføring gjennom injeksjon av avian retroviruses intracardiacally i RIP-Tag; RIP-LiveTV mus. Vellykket infeksjon med RCASBP-avledet avian retroviruses krever aktivt voksende målcellene. Derfor valgte vi RIP-Tag; RIP-LiveTV mus for 7 ukens av alderen, når hyperplasia utvikler på ca 50% av bukspyttkjertelen øyene. Venstre ventrikkel intracardiac injeksjon av høy titer virus er nødvendig for å oppnå en infeksjon virkningsgrad på 10-20% 4. Før virus når bukspyttkjertelen holmer, reduserer dette leveringsmåte betydelig fortynning av virus partikler i sirkulasjon.
Bruker denne tilnærmingen, har vi tidligere vist at Bcl-xL fremmer kreft metastasering uavhengig av sin anti-apoptotisk funksjonen 4,9. Anti-apoptotisk-uavhengig metastatisk funksjonen ble ikke observert når Bcl-xL ble uttrykt via en transgene i alle bukspyttkjertelen β celler gjennom tumorigenic Ontogenese i RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mus modell 10. Derfor tilbyr våre musemodell en unik mulighet til å identifisere og karakterisere gener funksjoner når uttrykt på et senere stadium av tumorigenesis. Fordi 2-4% av holmer utvikle i svulst i RIP-Tag; RIP-LiveTV bitransgenic mus uten viral infeksjon og ikke alle premalignant lesjoner er infisert med RCASBP-avledet avian retroviruses, bare faktorene som overdrar en selektiv fordel over den naturlige løpet av tumorigenesis kan identifiseres. Spesielt oppfattes metastatisk faktorer mest lett av denne metoden fordi metastasering bukspyttkjertelen lymfeknuter eller andre organer ikke vanligvis forekommer i RIP-Tag; RIP-LiveTV mus.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne studien beskrev vi en kraftig musemodell, RIP-Tag; RIP-LiveTV, å oppnå somatiske gen levering via avian retroviruses for identifikasjon og karakterisering av metastatisk faktorer. Selv om RIP-Tag; RIP-LiveTV mus utvikle bukspyttkjertelen neuroendocrine svulster, metastatisk faktorer i denne musemodell kan også fremme metastasering av andre typer kreft.
Vår tilnærming har fordelen av å innføre somatiske genetiske endringer spesifikt inn premalignant lesjoner av …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong og Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. støttes av DOD grant W81XWH-16-1-0619 og NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
