Identifiering och karakterisering av metastaserande faktorer av genöverföring i romanen RIP-taggen; RIP-tva murina modell
Summary
Vi presenterar ett protokoll för att visa en del av ett system för överföring av somatisk gen utnyttja RIP-Tag; RIP-tva musmodell att studera funktionen av gener i metastaser. De aviär retrovirus levereras intracardiacally för att säkerställa genöverföring till pre-maligna, noninvasiv lesioner av pankreas β-celler i vuxna möss.
Abstract
Metastaserande cancer står för 90 procent av dödsfallen hos patienter med solida tumörer. Det finns ett brådskande behov av att bättre förstå förare av cancer metastaser och identifiera nya terapeutiska mål. För att undersöka molekylära händelser som driver utvecklingen från primär cancer till metastas, har vi utvecklat en bitransgenic musmodell, RIP-Tag; RIP-tva. I denna musmodell driver råtta insulin arrangören (RIP) uttryck för SV40 T antigenet (Tag) och receptorn för undergruppen aviär leukos virus (tva) i pankreas β-celler. Möss utvecklar pankreas neuroendokrina tumörer med 100% penetrans genom väldefinierade steg som liknar människans uppkomst, med stadier inklusive hyperplasi, angiogenes, adenom och invasiva carcinom. Eftersom RIP-Tag; RIP-tva möss inte utvecklar metastaserande sjukdom, genetiska förändringar som främjar metastaser kan identifieras enkelt. Somatisk gen överför till tva-uttryckande, frodas pankreas β premaligna lesioner uppnås genom intrakardiellt injektion av aviär retrovirus härbärgerat den önskade genetiska förändringen. En titer av > 1 x 108 infektiösa enheter per ml anses lämpligt för i vivo infektion. Dessutom kan aviär retrovirus infektera cellinjer som härstammar från tumörer i RIP-Tag; RIP-tva möss med hög verkningsgrad. Cellinjer kan också användas för att karaktärisera de metastaserande faktorerna. Här visar vi hur att utnyttja denna musmodell och cellinjer för att bedöma fungerar av kandidatgener i tumör metastasering.
Introduction
De flesta cancerformer uppkommer somatiska mutationer 1. Konventionella genetiskt modifierade musmodeller (GEMM) har gett betydande insikter i bidrag till specifika genetiska förändringar till tumourigenesis 2. De har dock flera begränsningar. Den stora nackdelen med dessa modeller är att inte replikera de datatillämpningar tumörbildning hos människa, där endast vissa celler i en vävnad förvärva genetiska förändringar. Mutationerna i transgena och knockout möss är också könsceller med potential att påverka utvecklingen. Dessutom är genererar dessa musmodeller dyra och tidskrävande.
Metastaser är en viktig fråga i fältet av cancer. Modeling metastaser har varit svårt i GEMM. Spontan metastaser är sällsynt i musen. Penetrans är variabel och latens är lång i GEMM metastaser 3. Experimentell metastaser modeller sysselsätter direkt injektion av celler i cirkulationen av möss, så de tidiga stegen i metastaserande kaskad elimineras.
För att övervinna några av ovanstående begränsningar i att studera metastaserande faktorer i musmodeller, har vi utvecklat en bitransgenic musmodell, RIP-Tag; RIP-tva4. Strategin bygger på att kombinera ett högt-synkroniserad tumör progression musmodell, RIP-Tag 5, och receptorn för undergruppen-A aviär leukos virus, tva 6,7. Denna RIP-tagg; RIP-tvamusmodell tillåter gener införs somatically till en enda bitransgenic mus stam. Med SV40 T antigenet undertrycka tumör suppressiv funktioner Rb och p53, utvecklar möss pankreas neuroendokrina tumörer i ett liknande sätt som människans uppkomst, med stadier inklusive hyperplasi, angiogenes, adenom och invasiva carcinom. RIP-Tag modellen har varit mycket lärorikt för vår förståelse av kännetecknen för cancer, inte begränsat till bukspottskörteln neuroendokrina tumörer. Det har också använts i prekliniska studier 8.
Vi presenterar ett protokoll för somatiska genöverföring genom injektion av aviär retrovirus intracardiacally i RIP-Tag; RIP-tva möss. Framgångsrik infektion med RCASBP-derived aviär retrovirus kräver aktivt prolifererande målceller. Därför valde vi RIP-Tag; RIP-tva möss vid 7 veckors ålder, när hyperplasi utvecklar cirka 50% av Langerhanska. Vänstra ventrikulära intrakardiellt injektion av hög titer virus krävs för att uppnå en infektion verkningsgrad på 10-20% 4. Denna leveransmetod minskar betydande utspädning av viruspartiklar inom cirkulationen innan virus når Langerhanska.
Använder denna metod, har vi tidigare visat att Bcl-xL främjar cancer metastaser oberoende av dess anti-apoptotiska funktion 4,9. Denna anti-apoptotiska-oberoende metastaserande funktion observerades inte när Bcl-xL uttrycktes via en transgen i alla pankreas β-celler i hela tumörframkallande Ontogeni i RIP-Tag; RIP-Bcl-xL mus modell 10. Därför erbjuder våra musmodell en unik möjlighet att identifiera och karaktärisera gener funktioner när uttryckt i ett senare skede av tumourigenesis. Eftersom 2-4% av holmar utvecklas till tumörer i RIP-Tag; RIP-tva bitransgenic möss utan viral infektion och inte alla premaligna lesioner är infekterade med de RCASBP-derived aviär retrovirus, endast de faktorer som ger en selektiv fördel under naturliga uppkomst kan identifieras. I synnerhet känns metastaserande faktorer lättast igen av denna metod, eftersom metastaser bukspottskörteln lymfkörtlar eller andra organ inte förekommer normalt i RIP-Tag; RIP-tva möss.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denna studie beskrev vi en kraftfull musmodell, RIP-Tag; RIP-tva, att uppnå somatisk gen leverans via aviär retrovirus för identifiering och karakterisering av metastaserande faktorer. Även om RIP-Tag; RIP-tva möss utvecklar pankreas neuroendokrina tumörer, metastaserad faktorer som anges i denna musmodell kan även främja metastas av andra typer av cancer.
Vår metod har fördelen att införa somatiska genetiska förändringar specifikt i premaligna lesioner av pank…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Harold Varmus, Brian C. Lewis, Douglas Hanahan, Danny Huang, Sharon Pang, Megan Wong och Manasi M. Godbole. Y.C.N.D. stöds av DOD grant W81XWH-16-1-0619 och NIH grant 1R01CA204916.
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
