पहचान और उपंयास चीर-टैग में जीन हस्तांतरण द्वारा मेटास्टेटिक कारकों के लक्षण वर्णन ; चीर-tva Murine मॉडल
Summary
हम एक उपंयास दैहिक जीन हस्तांतरण प्रणाली का उपयोग चीर-टैग के लिए प्रदर्शित करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ; चीर-tva माउस मॉडल मेटास्टेसिस में जीन के समारोह का अध्ययन करने के लिए । एवियन retroviruses वयस्क चूहों में अग्नाशय β कोशिकाओं के पूर्व घातक, गैर इनवेसिव घावों में जीन हस्तांतरण सुनिश्चित करने के लिए intracardiacally दिया जाता है ।
Abstract
मेटास्टेटिक कैंसर ठोस ट्यूमर के साथ रोगियों में होने वाली मौतों के ९०% के लिए खातों । वहां एक तत्काल के लिए बेहतर कैंसर मेटास्टेसिस के ड्राइवरों को समझने की जरूरत है और उपंयास चिकित्सीय लक्ष्यों की पहचान है । आणविक घटनाओं कि प्राथमिक कैंसर से मेटास्टेसिस के लिए प्रगति ड्राइव की जांच करने के लिए, हम एक bitransgenic माउस मॉडल विकसित किया है, चीर टैग; चीर-tva। इस माउस मॉडल में, चूहा इंसुलिन प्रवर्तक (चीर) SV40 टी प्रतिजन की अभिव्यक्ति ड्राइव (टैग) और उपसमूह के लिए रिसेप्टर एक एवियन leukosis वायरस (tva) अग्नाशय β कोशिकाओं में. चूहों हाइपरप्लासिया, angiogenesis, ग्रंथ्यर्बुद, और इनवेसिव कार्सिनोमा सहित चरणों के साथ अच्छी तरह से परिभाषित चरणों है कि मानव tumorigenesis के समान हैं के माध्यम से १००% penetrance के साथ अग्नाशय neuroendocrine ट्यूमर विकसित करना । क्योंकि रिप-टैग; चीर-tva चूहों मेटास्टेटिक रोग का विकास नहीं है, आनुवंशिक परिवर्तन है कि मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने के आसानी से पहचाना जा सकता है । tva में दैहिक जीन अंतरण-व्यक्त, proliferating अग्नाशय β घातक घावों के intracardiac इंजेक्शन के माध्यम से प्राप्त किया है एवियन retroviruses वांछित आनुवंशिक परिवर्तन बंदरगाह. A titer of & #62; 1 x 108 संक्रामक इकाइयों प्रति एमएल vivo संक्रमण में के लिए उपयुक्त माना जाता है । इसके अलावा, एवियन retroviruses चीर-टैग में ट्यूमर से व्युत्पंन कोशिका लाइनों को संक्रमित कर सकते हैं ; चीर- उच्च दक्षता के साथ चूहों tva । मेटास्टेटिक कारकों को चिह्नित करने के लिए कक्ष रेखाओं का भी उपयोग किया जा सकता है । यहां हम प्रदर्शन कैसे इस माउस मॉडल और सेल लाइनों का उपयोग करने के लिए ट्यूमर मेटास्टेसिस में उंमीदवार जीन के कार्यों का आकलन ।
Introduction
अधिकांश कैंसर दैहिक उत्परिवर्तनों से पैदा होता है 1। पारंपरिक आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMM) विशिष्ट आनुवंशिक परिवर्तन के योगदान में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान की है tumorigenesis 2। हालांकि, वे कई सीमाएं हैं । इन मॉडलों की प्रमुख खामी यह है कि वे मानव में ट्यूमर के गठन की छिटपुट प्रकृति को दोहराने नहीं, जिसमें केवल एक ऊतक के भीतर कुछ कोशिकाओं आनुवंशिक परिवर्तन प्राप्त करते हैं । ट्रांसजेनिक और नॉकआउट चूहों में उत्परिवर्तन भी विकास को प्रभावित करने की क्षमता के साथ germline हैं । इसके अलावा, इन माउस मॉडल पैदा महंगी और समय लेने वाली है ।
मेटास्टेसिस कैंसर के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण मुद्दा है । GEMM में मॉडलिंग मेटास्टेसिस मुश्किल हो गया है । सहज मेटास्टेसिस माउस में दुर्लभ है । Penetrance चर है और लेटेंसी मेटास्टेसिस 3के GEMM में लंबा है । प्रयोगात्मक मेटास्टेसिस मॉडल चूहों के संचलन में कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन को रोजगार, तो मेटास्टेटिक झरना में प्रारंभिक कदम समाप्त कर रहे हैं.
माउस मॉडल में मेटास्टेटिक कारकों का अध्ययन करने में उपर्युक्त सीमाओं में से कुछ को दूर करने के लिए, हम एक bitransgenic माउस मॉडल, चीर-टैग विकसित किया है; चीर-tva4. रणनीति एक उच्च सिंक्रनाइज़ ट्यूमर प्रगति माउस मॉडल, चीर-टैग 5, और उपसमूह के लिए रिसेप्टर-एक एवियन leukosis वायरस, tva 6,7के उपयोग के संयोजन पर आधारित है । इस चीर-टैग; चीर-tvaमाउस मॉडल जीन एक एकल bitransgenic माउस तनाव में दैहिक शुरू करने की अनुमति देता है । SV40 टी प्रतिजन आरबी और p53 के ट्यूमर शमन कार्यों को दबाने के साथ, चूहों मानव tumorigenesis के लिए एक समान फैशन में अग्नाशय neuroendocrine ट्यूमर का विकास, हाइपरप्लासिया, angiogenesis, ग्रंथ्यर्बुद, और इनवेसिव कार्सिनोमा सहित चरणों के साथ. इस चीर टैग मॉडल कैंसर की पहचान की हमारी समझ के लिए बहुत शिक्षाप्रद है, अग्नाशय neuroendocrine ट्यूमर तक ही सीमित नहीं है । यह भी नैदानिक परीक्षण 8में इस्तेमाल किया गया है ।
हम चीर-टैग में एवियन retroviruses intracardiacally के इंजेक्शन के माध्यम से दैहिक जीन हस्तांतरण के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ; चीर-tva चूहे । RCASBP-व्युत्पन्न एवियन retroviruses के साथ सफल संक्रमण सक्रिय रूप से proliferating लक्ष्य कोशिकाओं की आवश्यकता है. इसलिए, हमने रिप-टैग को चुना है; चीर-tva चूहों उंर के 7 सप्ताह में, जब हाइपरप्लासिया अग्नाशय के टाप के बारे में ५०% में विकसित करता है । वाम वेंट्रिकुलर उच्च titer वायरस के intracardiac इंजेक्शन 10-20% 4के एक संक्रमण दक्षता प्राप्त करने के लिए आवश्यक है । यह वितरण विधि वायरस अग्नाशय के टाप तक पहुंचने से पहले संचलन के भीतर वायरल कणों के महत्वपूर्ण कमजोर पड़ने को कम कर देता है ।
इस दृष्टिकोण का प्रयोग, हम पहले दिखा दिया है कि Bcl-एक्स्ट्रा लार्ज कैंसर मेटास्टेसिस अपने विरोधी अपोप्तोटिक समारोह 4,9के स्वतंत्र बढ़ावा देता है । यह विरोधी अपोप्तोटिक-स्वतंत्र मेटास्टेटिक समारोह जब Bcl-एक्स्ट्रा लार्ज सभी अग्नाशय β कोशिकाओं में tumorigenic ontogeny भर में एक transgene के माध्यम से व्यक्त किया गया था नहीं देखा था चीर-टैग में; चीर-Bcl-एक्स्ट्रा लार्ज माउस मॉडल 10। इसलिए, हमारे माउस मॉडल की पहचान करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है और जीन कार्यों की विशेषताएं जब tumorigenesis के बाद के चरण में व्यक्त की । क्योंकि टाप के 2-4% चीर-टैग में ट्यूमर में विकसित ; चीर-tva bitransgenic चूहों वायरल संक्रमण के बिना और नहीं सभी घातक घावों RCASBP-व्युत्पंन एवियन retroviruses से संक्रमित हैं, केवल कारक है कि tumorigenesis के प्राकृतिक पाठ्यक्रम पर एक चयनात्मक लाभ प्रदान की पहचान की जा सकती है । विशेष रूप से, मेटास्टेटिक कारकों सबसे आसानी से इस विधि द्वारा मांयता प्राप्त हो जाएगा, क्योंकि अग्नाशय लिम्फ नोड्स या अंय अंगों के लिए मेटास्टेसिस में आम तौर पर नहीं होती है चीर-टैग; चीर-tva चूहे ।
Protocol
आचार वक्तव्य: पशुओं पर प्रयोग पशु देखभाल और Weill कॉर्नेल चिकित्सा के उपयोग समिति के लिए संस्थान द्वारा उल्लिखित दिशा निर्देशों और विनियमों के अनुसार किया गया ।
1. एवियन सिंड्रम वैक्टर की पस?…
Representative Results
Discussion
इस अध्ययन में, हम एक शक्तिशाली माउस मॉडल, चीर-टैग का वर्णन; चीर-tva, मेटास्टेटिक कारकों की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए एवियन retroviruses के माध्यम से दैहिक जीन वितरण को प्राप्त करने के लिए । हालांकि रिप-टैग; ची…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम हेरोल्ड Varmus, ब्रायन सी लुईस, डगलस हानाहान, डैनी हुआंग, शेरोन वेदना, Megan वोंग, और माणसी एम. गोडबोले धंयवाद । Y.C.N.D. DOD ग्रांट W81XWH-16-1-0619 और NIH ग्रांट 1R01CA204916 द्वारा समर्थित है ।
Materials
| RCASBP-Y DV plasmid | Addgene | 11478 | |
| RCAS-RNAi plasmid | Addgene | 15182 | |
| DMEM | Corning | 10-013-CV | |
| fetal bovine serum | Atlanta Biologicals | 25-005-CI | |
| L-glutamine, 100x | Corning | 25-005-CI | |
| Penicillin-Streptomycin solution, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| PBS-/-, 1X | Corning | 21-040-CV | |
| Superfect | Qiagen | 301305 | |
| Polyallomer centrifuge tube | Beckman Coulter | 326823 | |
| 0.45 mm Nalgene Syringe Filters with PES Membrane |
Thermo Scientific | 194-2545 | |
| Insulin Syringes | BD | 329461 | |
| synaptophysin | Vector Laboratories | VP-S284 | |
| VECTASTAIN Elite ABC HRP Kit (Peroxidase, Rabbit IgG) | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| AmpliTaq DNA Polymerase with Buffer II | Life Technologies | N8080153 | |
| MyTaq DNA Polymerase | Bioline | BIO-21106 |
References
- Vogelstein, B., Kinzler, K. W. The multistep nature of cancer. Trends Genet. 9 (4), 138-141 (1993).
- Walrath, J. C., Hawes, J. J., Van Dyke, T., Reilly, K. M. Genetically engineered mouse models in cancer research. Adv Cancer Res. 106, 113-164 (2010).
- Khanna, C., Hunter, K. Modeling metastasis in vivo. Carcinogenesis. 26 (3), 513-523 (2005).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS biology. 5 (10), e276 (2007).
- Hanahan, D. Heritable formation of pancreatic beta-cell tumours in transgenic mice expressing recombinant insulin/simian virus 40 oncogenes. Nature. 315 (6015), 115-122 (1985).
- Fisher, G. H., et al. Development of a flexible and specific gene delivery system for production of murine tumor models. Oncogene. 18 (38), 5253-5260 (1999).
- Orsulic, S. An RCAS-TVA-based approach to designer mouse models. Mamm Genome. 13 (10), 543-547 (2002).
- Tuveson, D., Hanahan, D. Translational medicine: Cancer lessons from mice to humans. Nature. 471 (7338), 316-317 (2011).
- Choi, S., et al. Bcl-xL promotes metastasis independent of its anti-apoptotic activity. Nat Commun. 7, 10384 (2016).
- Naik, P., Karrim, J., Hanahan, D. The rise and fall of apoptosis during multistage tumorigenesis: down-modulation contributes to tumor progression from angiogenic progenitors. Genes Dev. 10 (17), 2105-2116 (1996).
- Hughes, S. H., Greenhouse, J. J., Petropoulos, C. J., Sutrave, P. Adaptor plasmids simplify the insertion of foreign DNA into helper-independent retroviral vectors. J Virol. 61 (10), 3004-3012 (1987).
- Petropoulos, C. J., Payne, W., Salter, D. W., Hughes, S. H. Appropriate in vivo expression of a muscle-specific promoter by using avian retroviral vectors for gene transfer [corrected]. J Virol. 66 (6), 3391-3397 (1992).
- Dunn, K. J., Williams, B. O., Li, Y., Pavan, W. J. Neural crest-directed gene transfer demonstrates Wnt1 role in melanocyte expansion and differentiation during mouse development. Proc Natl Acad Sci USA. 97 (18), 10050-10055 (2000).
- Loftus, S. K., Larson, D. M., Watkins-Chow, D., Church, D. M., Pavan, W. J. Generation of RCAS vectors useful for functional genomic analyses. DNA Res. 8 (5), 221-226 (2001).
- Bromberg-White, J. L., et al. Delivery of short hairpin RNA sequences by using a replication-competent avian retroviral vector. J Virol. 78 (9), 4914-4916 (2004).
- Harpavat, S., Cepko, C. L. RCAS-RNAi: a loss-of-function method for the developing chick retina. BMC Dev Biol. 6 (2), (2006).
- Huse, J. T., et al. The PTEN-regulating microRNA miR-26a is amplified in high-grade glioma and facilitates gliomagenesis in vivo. Genes Dev. 23 (11), 1327-1337 (2009).
- Ahronian, L. G., Lewis, B. C. Generation of high-titer RCAS virus from DF1 chicken fibroblasts. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (11), 1161-1166 (2014).
- Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (2012).
- Du, Y. C., Lewis, B. C., Hanahan, D., Varmus, H. Assessing tumor progression factors by somatic gene transfer into a mouse model: Bcl-xL promotes islet tumor cell invasion. PLoS Biol. 5 (10), 2255-2269 (2007).
- Du, Y. C., Chou, C. K., Klimstra, D. S., Varmus, H. Receptor for hyaluronan-mediated motility isoform B promotes liver metastasis in a mouse model of multistep tumorigenesis and a tail vein assay for metastasis. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (40), 16753-16758 (2011).
- Guernet, A., Grumolato, L. CRISPR/Cas9 editing of the genome for cancer modeling. Methods. , (2017).
