عزل من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من عضلات الماوس الهيكل العظمي
Summary
يصف هذا العمل بروتوكول يستند إلى فاكس التي تسمح لعزل سهلة ومتزامنة من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من العضلات والهيكل العظمي.
Abstract
بيريسيتس هي الخلايا متعددة الأوعية المحيطة بالأوعية التي تظهر عدم التجانس في أجهزة مختلفة أو حتى داخل نفس الأنسجة. في العضلات والهيكل العظمي، وهناك ما لا يقل عن اثنين من المجموعات السكانية بيريسيت (تسمى النوع الأول والنوع الثاني)، والتي تعبر عن علامات الجزيئية المختلفة ولها قدرات التمايز متميزة. باستخدام NG2-دسرد و نستين-غفب الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة، نوع I (NG2-دسرد + نستين-غفب) والنوع الثاني (NG2-دسرد + نستين-غفب + ) بيريسيتس تم عزلها بنجاح. ومع ذلك، فإن توافر هذه الفئران المعدلة وراثيا المزدوج يمنع الاستخدام الواسع النطاق لهذه الطريقة تنقية. يصف هذا العمل بروتوكول بديل يسمح لعزل سهلة ومتزامنة من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس من العضلات والهيكل العظمي. يستخدم هذا البروتوكول تقنية الفلورسنت تنشيط الفرز (فاكس) ويستهدف PDGFRβ، بدلا من NG2، جنبا إلى جنب مع إشارة نستن غفب. بعد العزلة، اكتب الأول و تيبي بيريتسيتس الثاني تظهر مورفولوجيز متميزة. وبالإضافة إلى ذلك، النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس معزولة مع هذه الطريقة الجديدة، مثل تلك المعزولة من الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة، هي أديبوجينيك و ميوجينيك، على التوالي. وتشير هذه النتائج إلى أن هذا البروتوكول يمكن أن تستخدم لعزل المجموعات السكانية بيراسيت من العضلات والهيكل العظمي وربما من أنسجة أخرى.
Introduction
ضمور العضلات هو اضطراب العضلات التنكسية التي ليس لديها علاجات فعالة حتى الآن. وقد كان تطوير العلاجات التي تعزز تجديد الأنسجة دائما ذات فائدة كبيرة. الأنسجة تجديد وإصلاح بعد الضرر تعتمد على الخلايا الجذعية المقيمين / الخلايا السلف 1 . وتلتزم الخلايا الأقمار الصناعية الخلايا السلائف عضلي التي تسهم في تجديد العضلات 2 ، 3 ، 4 ، 5 ، 6 ، 7 . إلا أن استخدامها السريري يعوقه هجرة محدودة ومعدل البقاء على قيد الحياة بعد الحقن، فضلا عن انخفاض القدرة على التمايز بعد تضخيم في المختبر 8 ، 9 ، 10 ، 11 . بالإضافة إلى ساتليالخلايا التائية، والعضلات الهيكل العظمي تحتوي أيضا على العديد من السكان الخلايا الأخرى مع إمكانات عضلية 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، مثل الصفائح الدموية المستمدة من عامل النمو المستقبلة بيتا (PDGFRβ) الخلايا الخلالية إيجابية. هناك أدلة تبين أن خلايا PDGFRβ + المشتقة من العضلات هي قادرة على التفريق في الخلايا العضلية وتحسين أمراض العضلات وظيفة 14 ، 17 ، 18 ، 19 ، 20 . PDGFRβ في الغالب تسميات بيريسيتس 21 ، والتي هي خلايا حول الأوعية مع تعدد القدرات 22 ، 23 . بالإضافة إلى PDGFRβ، وتستخدم أيضا العديد من علامات أخرى، بما في ذلك الخلايا العصبية 2 (NG2) و CD146، ل iدنتيفي بيريسيتس 21 . ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن أيا من هذه العلامات هو بيريسيت محددة 21 . كشفت الدراسات الحديثة نوعين فرعيين من بيريسيتس العضلات، ودعا النوع الأول والنوع الثاني، والتي تعبر عن علامات الجزيئية المختلفة وتنفيذ وظائف متميزة 19 ، 24 ، 25 . بيوشيميكالي، نوع I بيريسيتس هي NG2 + نيستين – ، في حين أن النوع الثاني بيريسيتس هي NG2 + نيستين + 19 ، 24 . وظيفيا، النوع الأول بيريسيتس يمكن أن يخضع التمايز أديبوجينيك، والمساهمة في تراكم الدهون و / أو التليف، في حين أن النوع الثاني بيريسيتس يمكن التفريق على طول مسار عضلي، والمساهمة في تجديد العضلات 19 ، 24 ، 25 . وتظهر هذه النتائج ما يلي: (1) النوع الأول بيريسيتس قد به المستهدفة في علاج الاضطرابات التنكسية الدهنية / التليف، و (2) النوع الثاني بيريسيتس لديها إمكانات علاجية كبيرة لضمور العضلات. مزيد من التحقيق وتوصيف هذه المجموعات السكانية تتطلب بروتوكول العزل التي تمكن من فصل النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس على مستوى عال من النقاء.
حاليا، ويعتمد على العزلة من المجموعات السكانية بيريسيت على NG2-دسرد و Nestin- غفب الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة 19 ، 24 . توافر الفئران NG2-دسرد ونوعية معظم الأجسام المضادة NG2 تحد من الاستخدام الواسع النطاق لهذه الطريقة. وبالنظر إلى أن جميع NG2 + بيريسيتس أيضا التعبير عن PDGFRβ في العضلات والهيكل العظمي 19 و 20 و 24 ، ونحن نفترض أن NG2 يمكن الاستعاضة عنها PDGFRβ لعزل بيريسيتس والقطاعات السكانية الفرعية. يصف هذا العمل بروتوكول يستند إلى نظام مراقبة الأصول الميدانيةيستخدم تلطيخ PDGFR and وإشارة نيستن-غفب. هذه الطريقة أقل تطلبا للمحققين بسبب: (1) أنها لا تتطلب خلفية NG2-دسرد و (2) أنها تستخدم تجاريا PDGFR available المتاحة الأجسام المضادة، والتي تتميز جيدا. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يتيح العزلة في وقت واحد من النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس في نقاء عالية، مما يسمح لمزيد من التحقيق في البيولوجيا والإمكانات العلاجية لهذه المجموعات السكانية بيراسيت. بعد تنقية، يمكن زرع هذه الخلايا في الثقافة، ويمكن تصور مورفولوجيس بهم. ويظهر هذا العمل أيضا أن النوع الأول والنوع الثاني بيريسيتس معزولة باستخدام هذه الطريقة، مثل تلك المنقى من الفئران المعدلة وراثيا مزدوجة، هي أديبوجينيك و ميوجينيك، على التوالي.
Protocol
Representative Results
Discussion
بيريسيتس متعددة الخلايا المحيطة بالأوعية 22 ، 23 تقع على السطح الشعري للشعيرات الدموية 21 ، 26 . في العضلات والهيكل العظمي، بيريسيتس هي قادرة على التفريق على طول مسارات أديبوجينيك و / أو عضلي 19 <…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد حظي هذا العمل بدعم جزئي من منحة مقدمة من الصندوق من مؤسسة ميوتونيك ديستروفي (مدف-فف-2014-0013) ومنحة التنمية العلمية من جمعية القلب الأمريكية (16SDG29320001).
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
