Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Maus Skelettmuskeln
Summary
Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, das eine einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht.
Abstract
Pericytes sind perivaskuläre multipotenten Zellen, die Heterogenität in verschiedenen Organen oder sogar innerhalb desselben Gewebes zeigen. In Skelettmuskeln gibt es mindestens zwei pericyte Subpopulationen (genannt Typ I und Typ II), die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Differenzierungsfähigkeiten aufweisen. Unter Verwendung von NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen wurden Typ I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) und Typ-II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) Perizyten erfolgreich isoliert. Die Verfügbarkeit dieser doppelt-transgenen Mäuse verhindert jedoch die weit verbreitete Anwendung dieser Reinigungsmethode. Diese Arbeit beschreibt ein alternatives Protokoll, das die einfache und gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten aus Skelettmuskeln ermöglicht. Dieses Protokoll nutzt die Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) -Technik und zielt auf PDGFRβ und nicht auf NG2 zusammen mit dem Nestin-GFP-Signal. Nach der Isolation geben Sie I und ty einPe II pericytes zeigen deutliche Morphologien. Darüber hinaus sind Typ I und Typ II Perizyte, die mit dieser neuen Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus den doppelt-transgenen Mäusen isoliert wurden, adipogen und myogenisch. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass dieses Protokoll verwendet werden kann, um pericyte Subpopulationen aus Skelettmuskeln und möglicherweise aus anderen Geweben zu isolieren.
Introduction
Muskeldystrophie ist eine Muskel-degenerative Erkrankung, die bisher keine wirksamen Behandlungen hat. Die Entwicklung von Therapien, die die Geweberegeneration fördern, war schon immer von großem Interesse. Geweberegeneration und Reparatur nach Schädigung hängen von residenten Stammzellen / Vorläuferzellen ab 1 . Satellitenzellen sind myogene Vorläuferzellen, die zur Muskelregeneration beitragen 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Ihre klinische Anwendung wird jedoch durch ihre begrenzte Migration und niedrige Überlebensrate nach der Injektion sowie durch ihre verminderte Differenzierungsfähigkeit nach in vitro Verstärkung 8 , 9 , 10 , 11 behindert. Zusätzlich zu satelliTe-Zellen, Skelettmuskeln enthalten auch viele andere Zellpopulationen mit myogenem Potenzial 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , wie Plättchen-abgeleitete Wachstumsfaktor-Rezeptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitielle Zellen. Es gibt Hinweise darauf, dass Muskel-abgeleitete PDGFRβ + -Zellen in der Lage sind, sich in myogene Zellen zu differenzieren und die Muskelpathologie und die Funktion 14 , 17 , 18 , 19 , 20 zu verbessern. PDGFRβ dominiert überwiegend Perizyten 21 , die perivaskuläre Zellen mit Pluripotenz 22 , 23 sind . Zusätzlich zu PDGFRβ werden auch viele andere Marker, darunter Neuron-Glial 2 (NG2) und CD146, verwendetZirbeln 21 Es ist jedoch zu beachten, dass keiner dieser Marker pericytspezifisch ist. Jüngste Studien zeigten zwei Subtypen von Muskelpericyten, genannt Typ I und Typ II, die unterschiedliche molekulare Marker exprimieren und unterschiedliche Funktionen ausführen 19 , 24 , 25 . Biochemisch sind Typ I Perizyten NG2 + Nestin – , während Typ II Perizyten NG2 + Nestin + 19 , 24 sind . Funktionell können Typ I Perizyten adipogene Differenzierung unterliegen, was zur Fettansammlung und / oder Fibrose beiträgt, während Typ-Periziten des Typs II entlang des myogenen Weges differenzieren können, was zur Muskelregeneration 19 , 24 , 25 beiträgt. Diese Ergebnisse zeigen, dass: (1) Typ I Perizyten kann bE in der Behandlung von fetthaltigen degenerativen Störungen / Fibrose gezielt, und (2) Typ II Perizyten haben ein großes therapeutisches Potential für die Muskeldystrophie. Eine weitere Untersuchung und Charakterisierung dieser Populationen erfordert ein Isolationsprotokoll, das die Trennung von Typ I und Typ II Perizyten auf einem hohen Reinheitsgrad ermöglicht.
Derzeit besteht die Isolierung von Pericyt-Subpopulationen auf NG2-DsRed- und Nestin-GFP-Doppel-transgenen Mäusen 19 , 24 . Die Verfügbarkeit von NG2-DsRed-Mäusen und die Qualität der meisten NG2-Antikörper begrenzen die weit verbreitete Anwendung dieser Methode. Da alle NG2 + pericytes auch PDGFRβ in den Skelettmuskeln 19 , 20 , 24 exprimieren, wird vermutet, dass NG2 durch PDGFRβ zur Isolierung von Perizyten und deren Subpopulationen ersetzt werden kann. Diese Arbeit beschreibt ein FACS-basiertes Protokoll, dasVerwendet PDGFRβ-Färbung und das Nestin-GFP-Signal. Diese Methode ist weniger anspruchsvoll für die Ermittler, weil: (1) es nicht den NG2-DsRed-Hintergrund erfordert und (2) es verwendet kommerziell erhältliche PDGFRβ-Antikörper, die gut charakterisiert sind. Darüber hinaus ermöglicht es die gleichzeitige Isolierung von Typ I und Typ II Perizyten in hoher Reinheit, was eine weitere Untersuchung der biologischen und therapeutischen Potenziale dieser Pericyt-Subpopulationen ermöglicht. Nach der Reinigung können diese Zellen in Kultur gezüchtet werden, und ihre Morphologien können sichtbar gemacht werden. Diese Arbeit zeigt auch, dass Typ I und Typ II Perizyme, die nach dieser Methode isoliert wurden, wie diejenigen, die aus doppelt-transgenen Mäusen gereinigt wurden, adipogene und myogene sind.
Protocol
Representative Results
Discussion
Perizythen sind multipotenten perivaskulären Zellen 22 , 23, die sich auf der abluminalen Oberfläche der Kapillaren 21 , 26 befinden . In Skelettmuskeln können Perizyten entlang der adipogenen und / oder myogenen Wege 19 , 20 , 24 differenzieren. Jüngste Studien zeigten zwei Subpopulationen von Perizyten mit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von einem Fund-A-Fellow-Stipendium der Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) und dem Scientist Development Grant von der American Heart Association (16SDG29320001) unterstützt.
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
References
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