Isolering af type I og type II pericytter fra muskelsmuskler
Summary
Dette arbejde beskriver en FACS-baseret protokol, der muliggør nem og samtidig isolering af type I og type II pericytter fra skelets muskler.
Abstract
Pericytter er perivaskulære multipotente celler, som viser heterogenitet i forskellige organer eller endog inden for samme væv. I skelets muskler er der mindst to perikate subpopulationer (kaldet type I og type II), som udtrykker forskellige molekylære markører og har forskellige differentieringsevner. Ved brug af NG2-DsRed og Nestin-GFP dobbelt-transgene mus er type I (NG2-DsRed + Nestin-GFP – ) og type II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytter isoleret med succes. Tilgængeligheden af disse dobbelt-transgene mus forhindrer imidlertid udbredt anvendelse af denne oprensningsmetode. Dette værk beskriver en alternativ protokol, der muliggør enkel og samtidig isolering af type I og type II pericytter fra skelets muskler. Denne protokol anvender den fluorescensaktiverede celle sortering (FACS) teknik og mål PDGFRβ, snarere end NG2 sammen med Nestin-GFP signalet. Efter isolation, type I og tyPe II pericytter viser forskellige morfologier. Desuden er type I og type II-pericytter isoleret med denne nye metode, som dem, der er isoleret fra de dobbelt-transgene mus, henholdsvis adipogene og myogene. Disse resultater tyder på, at denne protokol kan bruges til at isolere pericyte subpopulationer fra skelets muskler og muligvis fra andre væv.
Introduction
Muskeldystrofi er en muskel-degenerativ lidelse, der ikke har effektive behandlinger hidtil. Udviklingen af terapier, der fremmer vævregenerering, har altid været af stor interesse. Vævregenerering og reparation efter skade afhænger af hjemmehørende stamceller / stamceller 1 . Satellitceller er begået myogene precursorceller, der bidrager til muskelregenerering 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Deres kliniske anvendelse er imidlertid hæmmet af deres begrænsede migration og lav overlevelsesrate efter injektion, såvel som deres nedsatte differentieringsevne efter in vitro- amplifikation 8 , 9 , 10 , 11 . Ud over satellitTe-celler, skeletmuskler indeholder også mange andre cellepopulationer med myogen potentiale 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , såsom blodpladeafledte vækstfaktorreceptor-beta (PDGFRβ) -positive interstitiale celler. Der er tegn på, at muskelafledte PDGFRβ + -celler er i stand til at differentiere i myogene celler og forbedre muskelpatologi og funktion 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ overvejende mærker pericytter 21 , som er perivaskulære celler med pluripotens 22 , 23 . Foruden PDGFRβ anvendes mange andre markører, herunder Neuron-Glial 2 (NG2) og CD146, også tilDentify pericytes 21 . Det skal imidlertid bemærkes, at ingen af disse markører er pericytspecifikke 21 . Nylige undersøgelser afslørede to subtyper af muskelpericytter, kaldet type I og type II, som udtrykker forskellige molekylmarkører og udfører forskellige funktioner 19 , 24 , 25 . Biokemisk er type I pericytter NG2 + Nestin – mens type II pericytter er NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funktionelt kan type I pericytter undergå adipogen differentiering, der bidrager til fedtophopning og / eller fibrose, mens type II pericytter kan differentiere langs den myogene vej, hvilket bidrager til muskelregenerering 19 , 24 , 25 . Disse resultater viser at: (1) type I pericytter kan bE målrettet mod behandling af fedtdegenerative lidelser / fibrose, og (2) type II-pericytter har et stort terapeutisk potentiale for muskeldystrofi. Yderligere undersøgelse og karakterisering af disse populationer kræver en isolationsprotokol, der muliggør adskillelse af type I og type II pericytter på et højt niveau af renhed.
I øjeblikket er isolationen af pericyte-subpopulationer afhængig af NG2-DsRed og Nestin-GFP dobbelt-transgene mus 19 , 24 . Tilgængeligheden af NG2-DsRed-mus og kvaliteten af de fleste NG2-antistoffer begrænser den udbredt anvendelse af denne metode. Da alle NG2 + pericytes også udtrykker PDGFRβ i skelets muskler 19 , 20 , 24 , antager vi, at NG2 kan erstattes af PDGFRβ til isolering af pericytter og deres subpopulationer. Dette arbejde beskriver en FACS-baseret protokol somBruger PDGFRβ farvning og Nestin-GFP signalet. Denne metode er mindre krævende for efterforskere, fordi: (1) den ikke kræver NG2-DsRed-baggrunden og (2) den bruger kommercielt tilgængelige PDGFRβ-antistoffer, som er velkarakteriserede. Derudover muliggør den samtidig isolering af type I og type II pericytter med høj renhed, hvilket muliggør yderligere undersøgelse af biologiske og terapeutiske potentialer af disse pericyte subpopulationer. Efter oprensning kan disse celler dyrkes i kultur, og deres morfologier kan visualiseres. Dette arbejde viser også, at type I og type II-pericytter isoleret ved anvendelse af denne fremgangsmåde, som dem, der oprenses fra dobbelt-transgene mus, er henholdsvis adipogene og myogene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pericytter er multipotente perivaskulære celler 22 , 23 placeret på den abluminale overflade af kapillarerne 21 , 26 . I skelets muskler er pericytter i stand til at differentiere langs adipogene og / eller myogene veje 19 , 20 , 24 . Nylige undersøgelser afslørede to subpopulationer af pericytter med forske…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev delvist støttet af et fond-a-stipendium fra Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) og Scientific Development Grant fra American Heart Association (16SDG29320001).
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
