मास्क स्केलल स्नायुओं से प्रकार I और प्रकार II पेरीसिलटें का अलगाव
Summary
यह काम एक एफएसीएस-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो कंकल की मांसपेशियों से टाइप I और टाइप II पेरिसिट्स के आसान और एक साथ अलगाव के लिए अनुमति देता है।
Abstract
पेरीसिलेट परिधीय बहुपक्षीय कोशिकाएं हैं जो अलग-अलग अंगों में विविधता दिखाती हैं या एक ही ऊतक के भीतर भी। कंकाल की मांसपेशियों में, कम से कम दो पेरिसियल उप-जनसंख्या (प्रकार I और प्रकार II) कहा जाता है, जो अलग-अलग आणविक मार्करों को व्यक्त करते हैं और अलग भेदभाव की क्षमताएं होती हैं। NG2-DsRed और Nestin-GFP डबल ट्रांसजेनिक चूहों, प्रकार I (NG2-DsRed + Nestin-GFP – ) और टाइप II (एनजी 2-डीआरआरड + नेस्टिन-जीएफपी + ) पेरीसाइट्स का उपयोग करके सफलतापूर्वक पृथक किया गया है। हालांकि, इन दो-ट्रांसजेनिक चूहों की उपलब्धता इस शुद्धि पद्धति के व्यापक उपयोग को रोकती है। यह काम एक वैकल्पिक प्रोटोकॉल का वर्णन करता है जो कंकल की मांसपेशियों से टाइप I और टाइप II पर्सिलेइट के आसान और एक साथ अलगाव के लिए अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल ने प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) तकनीक का इस्तेमाल किया है और एनजी 2 के बजाय पीडीजीएफआरबी को लक्षित किया है, साथ ही नेस्टिन-जीएफपी सिग्नल के साथ। अलगाव के बाद, टाइप करें I और tyपे II परशीलाइट्स अलग आकारिकी दिखाते हैं इसके अलावा, इस नई विधि से पृथक I प्रकार और प्रकार II pericytes, जैसे कि दोहरे ट्रांसजेनिक चूहों से पृथक, क्रमशः एडीपीोजेनिक और मायोजेनिक हैं। ये परिणाम बताते हैं कि इस प्रोटोकॉल का उपयोग कंकाल की मांसपेशियों और अन्य ऊतकों से संभवतः पेर्लिसिट उपपोपों को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
Introduction
स्नायु डाइस्ट्रोफी एक मांसपेशी-डिजनेटिव डिसऑर्डर है जिस पर अभी तक कोई प्रभावी उपचार नहीं है। ऊतक पुनर्जनन को प्रोत्साहित करने वाले चिकित्सा का विकास हमेशा ब्याज के साथ रहा है। क्षति के बाद ऊतक पुनर्जनन और मरम्मत निवासी स्टेम कोशिकाओं / पूर्वज कोशिकाओं पर निर्भर करती है 1 । उपग्रह कोशिकाएं मेयोजेनिक पूर्ववर्ती कोशिकाएं बनाती हैं जो मांसपेशियों के उत्थान 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 में योगदान करती हैं। हालांकि उनके नैदानिक उपयोग, उनके सीमित प्रवासन और इंजेक्शन के बाद कम बचने की दर से प्रभावित होते हैं, साथ ही विट्रो प्रवर्धन 8 , 9 , 10 , 11 के बाद उनकी भिन्नता की क्षमता में कमी आई है। सैटेलाइट के अलावाते कोशिकाएं, कंकाल की मांसपेशियों में भी कई अन्य कोशिका आबादी होते हैं जो 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , जैसे कि प्लेटलेट-व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर-बीटा (पीडीजीएफआर बीओ) -कोजीज़िव इनस्टास्टियल सेल इसमें दिखाए गए सबूत हैं कि मांसपेशियों से प्राप्त पीडीजीएफआर बी + कोशिकाएं मायोजेनिक कोशिकाओं में अंतर कर सकती हैं और मांसपेशी विकृति और 14 , 17 , 18 , 1 9 , 20 समारोह को बेहतर कर सकती हैं। PDGFRβ मुख्यतः 21 pericytes लेबल है, जो pluripotency 22 , 23 के साथ perivascular कोशिकाओं रहे हैं पीडीजीएफआरβ के अतिरिक्त, न्यूरॉन-ग्लियाल 2 (एनजी 2) और सीडी 146 सहित कई अन्य मार्करों का भी उपयोग किया जाता है Iपेटीइटिस 21 को दबाएं यह ध्यान दिया जाना चाहिए, हालांकि, इन मार्करों में से कोई भी पीड़ित-विशिष्ट 21 नहीं है । हाल के अध्ययनों में मांसपेशियों की बर्फीले के दो उपप्रकारों से पता चला है, जिसे टाइप I और टाइप II कहा जाता है, जो अलग-अलग आणविक मार्करों को व्यक्त करते हैं और 19 , 24 , 25 को अलग-अलग कार्य करते हैं। बायोकैमिक रूप से, टाइप मी पेरिसेट्स एनजी 2 + नेस्टिन हैं, जबकि टाइप II पेरिसिट्स एनजी 2 + नेस्टिन +19 , 24 है । कार्यात्मक रूप से, टाइप मी पेरिसिट्स एडिपोजेनिक भेदभाव से गुजर सकता है, वसा संचय और / या फाइब्रोसिस में योगदान दे सकता है, जबकि टाइप II पेरिसैटेस माईोजेनिक मार्ग के साथ अंतर कर सकते हैं, मांसपेशियों के पुनर्जन्म में योगदान 1 9 , 24 , 25 । इन परिणामों से पता चलता है कि: (1) टाइप करें मैं पेरीसेलाइट हो सकता हैई फैटी डीजनरेटिव डिसऑर्डर / फाइब्रोसिस के उपचार में लक्षित है, और (2) टाइप II पर्सिलेइट्स में स्नायु डिस्ट्रोफी के लिए महान चिकित्सीय क्षमता है इन आबादी के आगे की जांच और लक्षण वर्णन के लिए एक अलगाव प्रोटोकॉल की आवश्यकता होती है जो कि उच्च स्तर के शुद्धता पर टाइप 1 और टाइप II पेरिसिट्स के अलग होने में सक्षम बनाता है।
वर्तमान में, पेर्लिसिट उप-जनसंख्या का अलगाव एनजी 2-डीआरआरडी और नेस्टिन-जीएफपी डबल ट्रांसजेनिक चूहों 19 , 24 पर निर्भर करता है। NG2-DsRed चूहों की उपलब्धता और अधिकांश एनजी 2 एंटीबॉडी की गुणवत्ता इस पद्धति के व्यापक उपयोग को सीमित करती है। यह देखते हुए कि सभी एनजी 2 + पेर्सेसाइट्स, कंकाल की मांसपेशियों 1 9 , 20 , 24 में पीडीजीएफआर बी को व्यक्त करते हैं, हम यह अनुमान लगाते हैं कि एनजी 2 को पीडीजीएफआर बी द्वारा पेरीसाइट्स के अलगाव के लिए और उनके उप-पोपों के लिए बदला जा सकता है। यह कार्य एफएसीएस-आधारित प्रोटोकॉल का वर्णन करता हैपीडीजीएफआर बीबी धुंधला और नेस्टिन-जीएफपी सिग्नल का उपयोग करता है यह विधि जांचकर्ताओं के लिए कम मांग है क्योंकि: (1) उसे एनजी 2-डीआरआर पृष्ठभूमि की आवश्यकता नहीं है और (2) यह वाणिज्यिक तौर पर उपलब्ध पीडीजीएफआर बीबी एंटीबॉडी का उपयोग करता है, जो अच्छी तरह से विशेषता है। इसके अलावा, यह उच्च शुद्धता पर टाइप 1 और टाइप II पेरिसिट्स के साथ-साथ अलग-अलग अलगाव को सक्षम बनाता है, जिससे इन पेर्सेलीटे उप-जनसांख्यिकी की जीव विज्ञान और चिकित्सीय क्षमता में आगे की जांच के लिए अनुमति मिलती है। शुद्धिकरण के बाद, इन कोशिकाओं को संस्कृति में उगाया जा सकता है, और उनके आकारिकी को कल्पना की जा सकती है। यह काम यह भी दिखाता है कि प्रकार I और प्रकार II pericytes इस पद्धति का उपयोग करके पृथक, जैसे कि डबल ट्रांसजेनिक चूहों से शुद्ध होते हैं, क्रमशः एडीपीोजेनिक और मायोजेनिक होते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
पेरीसिलेट्स मल्टीपोटेंट परिवस्कुलर कोशिकाओं 22 , 23 केशिकाओं 21 , 26 के एब्लायमनल सतह पर स्थित हैं। कंकाल की मांसपेशियों में, पेरीसाइट्स एडिपोजेनिक और / या मायोज…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आंशिक रूप से मायोटोनिक डिस्ट्रोफी फाउंडेशन (एमडीएफ-एफएफ-2014-0013) और अमेरिकन हार्ट एसोसिएशन (16 एसडीजी29320001) से वैज्ञानिक विकास अनुदान से फंड-ए-फेलो अनुदान द्वारा समर्थित था।
Materials
| Cell Sorter | Sony | SH800 | |
| Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
| DMEM | Gibco | 11995 | |
| Avertin | Sigma | T48402 | |
| Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
| MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
| Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
| Horse Serum | Sigma | H1270 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
| 0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
| PDL | Sigma | P6407 | |
| PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
| Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
| S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
| Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
| Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
| Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| HEPES | Gibco | 15630 | |
| EDTA | Fisher | BP120 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
| KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
| PBS | Gibco | 14190 | |
| 18G Needles | BD | 305196 | |
| 10ml Serological Pipette | BD | 357551 |
References
- Rennert, R. C., Sorkin, M., Garg, R. K., Gurtner, G. C. Stem cell recruitment after injury: lessons for regenerative medicine. Regenerative medicine. 7 (6), 833-850 (2012).
- Sambasivan, R., et al. Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).
- Relaix, F., Zammit, P. S. Satellite cells are essential for skeletal muscle regeneration: the cell on the edge returns centre stage. Development. 139 (16), 2845-2856 (2012).
- von Maltzahn, J., Jones, A. E., Parks, R. J., Rudnicki, M. A. Pax7 is critical for the normal function of satellite cells in adult skeletal muscle. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16474-16479 (2013).
- Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. M. An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration. Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).
- Kuang, S., Charge, S. B., Seale, P., Huh, M., Rudnicki, M. A. Distinct roles for Pax7 and Pax3 in adult regenerative myogenesis. J Cell Biol. 172 (1), 103-113 (2006).
- Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration. Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).
- Morgan, J. E., Pagel, C. N., Sherratt, T., Partridge, T. A. Long-term persistence and migration of myogenic cells injected into pre-irradiated muscles of mdx mice. J Neurol Sci. 115 (2), 191-200 (1993).
- Beauchamp, J. R., Morgan, J. E., Pagel, C. N., Partridge, T. A. Dynamics of myoblast transplantation reveal a discrete minority of precursors with stem cell-like properties as the myogenic source. J Cell Biol. 144 (6), 1113-1122 (1999).
- Partridge, T. A. Invited review: myoblast transfer: a possible therapy for inherited myopathies. Muscle Nerve. 14 (3), 197-212 (1991).
- Montarras, D., et al. Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration. Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).
- Asakura, A., Seale, P., Girgis-Gabardo, A., Rudnicki, M. A. Myogenic specification of side population cells in skeletal muscle. J Cell Biol. 159 (1), 123-134 (2002).
- Tamaki, T., et al. Skeletal muscle-derived CD34+/45- and CD34-/45- stem cells are situated hierarchically upstream of Pax7+ cells. Stem Cells Dev. 17 (4), 653-667 (2008).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes resident in postnatal skeletal muscle differentiate into muscle fibres and generate satellite cells. Nat Commun. 2, 499 (2011).
- Mitchell, K. J., et al. Identification and characterization of a non-satellite cell muscle resident progenitor during postnatal development. Nat Cell Biol. 12 (3), 257-266 (2010).
- Pannerec, A., Formicola, L., Besson, V., Marazzi, G., Sassoon, D. A. Defining skeletal muscle resident progenitors and their cell fate potentials. Development. 140 (14), 2879-2891 (2013).
- Dellavalle, A., et al. Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells. Nat Cell Biol. 9 (3), 255-267 (2007).
- Kostallari, E., et al. Pericytes in the myovascular niche promote post-natal myofiber growth and satellite cell quiescence. Development. 142 (7), 1242-1253 (2015).
- Birbrair, A., et al. Role of pericytes in skeletal muscle regeneration and fat accumulation. Stem Cells Dev. 22 (16), 2298-2314 (2013).
- Yao, Y., Norris, E. H., Mason, C. E., Strickland, S. Laminin regulates PDGFRbeta(+) cell stemness and muscle development. Nat Commun. 7, 11415 (2016).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Dore-Duffy, P. Pericytes: pluripotent cells of the blood brain barrier. Curr Pharm Des. 14 (16), 1581-1593 (2008).
- Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. J Cereb Blood Flow Metab. 26 (5), 613-624 (2006).
- Birbrair, A., et al. Skeletal muscle pericyte subtypes differ in their differentiation potential. Stem Cell Res. 10 (1), 67-84 (2013).
- Gautam, J., Nirwane, A., Yao, Y. Laminin differentially regulates the stemness of type I and type II pericytes. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 28 (2017).
- Birbrair, A., et al. Pericytes: multitasking cells in the regeneration of injured, diseased, and aged skeletal muscle. Front Aging Neurosci. 6, 245 (2014).
