Detta arbete beskriver ett FACS-baserat protokoll som möjliggör enkel och samtidig isolering av typ I och typ II pericytes från skelettmuskler.
Pericytes är perivaskulära multipotenta celler som visar heterogenitet i olika organ eller till och med inom samma vävnad. I skelettmusklerna finns det minst två perikita subpopuleringar (kallad typ I och typ II), vilka uttrycker olika molekylmarkörer och har tydliga differentieringsegenskaper. Med hjälp av NG2-DsRed och Nestin-GFP dubbel-transgena möss har typ I (NG2-DsRed + Nestin-GFP-) och typ II (NG2-DsRed + Nestin-GFP + ) pericytes isolerats framgångsrikt. Tillgängligheten av dessa dubbel-transgena möss förhindrar emellertid den utbredda användningen av denna reningsmetod. Detta arbete beskriver ett alternativt protokoll som möjliggör enkel och samtidig isolering av typ I och typ II pericytes från skelettmuskler. Detta protokoll använder den fluorescensaktiverade cellsorteringsmetoden (FACS) och riktar sig mot PDGFRβ, snarare än NG2, tillsammans med Nestin-GFP-signalen. Efter isolering, typ I och tyPe II pericytes visar olika morfologier. Dessutom är typ I och typ II-pericyter isolerade med denna nya metod, som de isolerade från de dubbel-transgena mössen, adipogena respektive myogena. Dessa resultat tyder på att detta protokoll kan användas för att isolera pericyte subpopulationer från skelettmuskler och eventuellt från andra vävnader.
Muskeldystrofi är en muskel-degenerativ sjukdom som hittills inte har några effektiva behandlingar. Utvecklingen av terapier som främjar vävnadsregenerering har alltid varit av stort intresse. Vävnadsregenerering och reparation efter skada beror på hemma stamceller / stamceller 1 . Satellitceller är begåvade myogena precursorceller som bidrar till muskelregenerering 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 . Deras kliniska användning hindras emellertid av deras begränsade migration och låg överlevnad efter injektion, liksom av deras minskade differentieringsförmåga efter in vitro- amplifiering 8 , 9 , 10 , 11 . Förutom satellitTe-celler, skelettmuskler innehåller också många andra cellpopulationer med myogen potential 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , såsom blodplätt-härledda tillväxtfaktorreceptor-beta (PDGFRβ) -positiva interstitiella celler. Det finns bevis som visar att muskelavledda PDGFRβ + -celler kan differentiera till myogena celler och förbättra muskelpatologin och funktionen 14 , 17 , 18 , 19 , 20 . PDGFRβ övervägande märker pericytes 21 , vilka är perivaskulära celler med pluripotens 22 , 23 . Förutom PDGFRβ används också många andra markörer, inklusive Neuron-Glial 2 (NG2) och CD146, tillDentify pericytes 21 . Det bör dock noteras att ingen av dessa markörer är pericytspecifik 21 . Tidigare studier avslöjade två subtyper av muskelpericytor, kallad typ I och typ II, vilka uttrycker olika molekylmarkörer och utför separata funktioner 19 , 24 , 25 . Biokemiskt är typ I pericytor NG2 + Nestin – medan typ II pericytes är NG2 + Nestin + 19 , 24 . Funktionellt kan typ I pericytes genomgå adipogen differentiering, vilket bidrar till fettackumulering och / eller fibros, medan typ II-pericytes kan differentiera längs den myogena vägen, vilket bidrar till muskelregenerering 19 , 24 , 25 . Dessa resultat visar att: (1) typ I pericytes kan bE riktade mot behandling av fettdegenerativa störningar / fibros och (2) typ II-pericyter har stor terapeutisk potential för muskeldystrofi. Ytterligare undersökning och karakterisering av dessa populationer kräver ett isoleringsprotokoll som möjliggör separering av typ I och typ II pericytes vid en hög renhetsgrad.
För närvarande är isoleringen av pericyte subpopuleringar beroende av NG2-DsRed och Nestin-GFP dubbel-transgena möss 19 , 24 . Tillgängligheten av NG2-DsRed-möss och kvaliteten på de flesta NG2-antikroppar begränsar den omfattande användningen av denna metod. Med tanke på att alla NG2 + pericytes också uttrycker PDGFRβ i skelettmusklerna 19 , 20 , 24 , förutser vi att NG2 kan ersättas med PDGFRβ för isoleringen av pericyter och deras subpopulationer. I det här arbetet beskrivs ett FACS-baserat protokoll somAnvänder PDGFRβ-färgning och Nestin-GFP-signalen. Denna metod är mindre krävande för utredare, eftersom: (1) den inte kräver NG2-DsRed-bakgrunden och (2) den använder kommersiellt tillgängliga PDGFRp-antikroppar, vilka är välkända. Dessutom möjliggör den samtidig isolering av typ I och typ II pericytes med hög renhet, vilket möjliggör ytterligare undersökning av biologiska och terapeutiska potentialen hos dessa pericyte subpopuleringar. Efter rening kan dessa celler odlas i odling och deras morfologier kan visualiseras. Detta arbete visar också att typ I och typ II-pericyter isolerade med användning av denna metod, som de som renats från dubbel-transgena möss, är adipogena respektive myogena.
Pericyter är multipotenta perivaskulära celler 22 , 23 belägna på den abluminala ytan av kapillärerna 21 , 26 . I skelettmusklerna kan pericyter differentiera längs adipogena och / eller myogena vägarna 19 , 20 , 24 . Tidigare studier avslöjade två subpopulationer av pericytor, med olika marköruttryck …
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av ett fond-A-stipendium från Myotonic Dystrophy Foundation (MDF-FF-2014-0013) och Scientific Development Grant från American Heart Association (16SDG29320001).
Cell Sorter | Sony | SH800 | |
Automatic Setup Beads | Sony | LE-B3001 | |
DMEM | Gibco | 11995 | |
Avertin | Sigma | T48402 | |
Pericyte Growth Medium | ScienCell | 1201 | |
MSC Basal Medium (Mouse) | Stemcell Technologies | 5501 | |
Adipogenic Stimulatory Supplement (Mouse) | Stemcell Technologies | 5503 | |
Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 | |
Horse Serum | Sigma | H1270 | |
Collagenase Type 2 | Worthington | LS004176 | |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco | 25200 | |
Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 | |
PDL | Sigma | P6407 | |
PDGFRβ-PE Antibody | eBioscience | 12-1402 | |
Perilipin Antibody | Sigma | P1998 | |
S-Myosin Antibody | DSHB | MF-20 | |
Alexa 555-anti-rabbit antibody | ThermoFisher Scientific | A-31572 | |
Alexa 555-anti-mouse antibody | ThermoFisher Scientific | A-31570 | |
Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
DAPI | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
HEPES | Gibco | 15630 | |
EDTA | Fisher | BP120 | |
BSA | Sigma | A2058 | |
NH4Cl | Fisher Scientific | A661 | |
KHCO3 | Fisher Scientific | P184 | |
PBS | Gibco | 14190 | |
18G Needles | BD | 305196 | |
10ml Serological Pipette | BD | 357551 |