पेप्टाइड माइक्रोरायर्स के साथ हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता का विश्लेषण
Summary
यह पांडुलिपि एंटीबॉडी की विशिष्टता प्रोफाइलिंग के लिए पेप्टाइड माइक्रोएरे तकनीक को लागू करने के तरीकों का वर्णन करती है जो कि हिस्टोन्स और उनके बाद के अनुवादकारी संशोधनों को पहचानते हैं।
Abstract
हिस्टोन प्रोटीनों पर पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी संशोधनों (पीटीएम) का व्यापक रूप से क्रोमेटिन संरचना और जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने में उनकी भूमिकाओं के लिए अध्ययन किया गया है। हिस्टोन्स पीटीएम के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के बड़े पैमाने पर उत्पादन और वितरण ने इन अंकों के शोध में काफी मदद की है। जैसे हीस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी कई क्रोमैटिन जैव रसायन अनुप्रयोगों के लिए प्रमुख अभिकर्मकों हैं, सटीक डेटा व्याख्या और क्षेत्र में जारी प्रगति के लिए एंटीबॉडी विशिष्टता का कठोर विश्लेषण आवश्यक है। इस प्रोटोकॉल में हिस्टोन एंटीबॉडी की विशिष्टता को परिभाषित करने के लिए पेप्टाइड माइक्रोएरे के डिजाइन, निर्माण और उपयोग के लिए एकीकृत पाइपलाइन का वर्णन किया गया है। इस प्रक्रिया के डिजाइन और विश्लेषण पहलुओं को आसानी से माइक्रोएरे प्रिंट स्वरूपों के अनुकूलन को सुव्यवस्थित करने के लिए विकसित एक खुला स्रोत और इंटरैक्टिव सॉफ्टवेयर पैकेज, अररेनिनजा द्वारा सहायता प्रदान की गई है। इस पाइपलाइन का उपयोग बड़ी संख्या में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और व्यापक रूप से इस्तेमाल किए जाने वाले हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी को स्क्रीन करने के लिए किया गया हैएस, और इन प्रयोगों से उत्पन्न डेटा एक ऑनलाइन और विस्तारित हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता डेटाबेस के माध्यम से स्वतंत्र रूप से उपलब्ध है। हिस्टॉन्स से परे, यहां वर्णित सामान्य पद्धति PTM- विशिष्ट एंटीबॉडी के विश्लेषण के लिए मोटे तौर पर लागू की जा सकती है।
Introduction
जीनोमिक डीएनए सुंदर रूप से यूकेरियोटिक सेल नाभिक के अंदर हीस्टोन प्रोटीन के साथ क्रोमेटिन बनाने के लिए पैक किया गया है। क्रोमैटिन का दोहराव उप-भाग न्यूक्लिओसॉम है, जिसमें एचआईएए, एच 2 बी, एच 3, और एच 4 1 – एचिस्टाइन प्रोटीन के एक अक्टेमरिक कोर के चारों ओर लिपटा डीएनए के 147 आधार जोड़े शामिल हैं। क्रोमैटिन मोटे तौर पर ढीले से पैक यूक्ट्रोटिन में व्यवस्थित किया जाता है और कसकर पैक किया गया हैटेरोरामेटिन डोमेन। क्रोमैटिन कंपैक्शन की डिग्री, जो कि प्रोटीन मशीनरी मूलभूत डीएनए टेम्पलेटेड प्रक्रियाओं जैसे प्रतिकृति, प्रतिलेखन और मरम्मत करने के लिए अंतर्निहित डीएनए का उपयोग कर सकती है, उस सीमा को नियंत्रित करती है।
क्रोमेटिन के सन्दर्भ में जीनोम पहुंच के प्रमुख नियामक पीटीएम हैं जो हिस्टोन प्रोटीन के अनस्ट्रक्टेड पूंछ और कोर डोमेन पर हैं , 2 , 3 । हिस्टोन PTMs सीधे क्रोमेटिन 4 की संरचना को प्रभावित करके और अप्रत्यक्ष रूप से throug कार्य करते हैंज। रीडर प्रोटीन की भर्ती और उनके जुड़े मैक्रोमोलेकुलर परिसरों में क्रोमेटिन रीमॉडेलिंग, एंजाइमेटिक, और मचान गतिविधियों 5 है । पिछले दो दशकों में हिस्टोन पीटीएम समारोह के अध्ययन से यह संकेत मिलता है कि ये निशान सेल भाग्य, जीव-विकास, और रोग की दीक्षा / प्रगति को विनियमित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। जन स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित प्रोटिओमिक टेक्नोलॉजी में अग्रिमों द्वारा इंधन, 80 से ज्यादा विशिष्ट हिस्टोन पीटीएम से 80 अलग-अलग हिस्टोन अवशेषों पर 6 की खोज की गई है। विशेष रूप से, ये संशोधनों अक्सर संयोजन में होती हैं, और "हिस्टोन कोड" परिकल्पना के अनुरूप होती हैं, कई अध्ययनों से पता चलता है कि पाठक प्रोटीन हिस्टोन PTMs 7 , 8 , 9 के विशिष्ट संयोजनों की पहचान के माध्यम से क्रोमैटिन के असतत क्षेत्रों को लक्षित कर रहे हैं। एक महत्वपूर्ण चुनौती आगे बढ़ने के लिए जीआर को कार्य सौंपेगीहिस्टोन पीटीएम की सूची के मुताबिक और यह पता लगाने के लिए कि हिस्टोन पीटीएम के विशिष्ट संयोजनों में क्रोमैटिन से जुड़े गतिशील कार्यों का परीक्षण किया गया है।
एंटीबॉडी हिस्टोन पीटीएम की पहचान के लिए लिंचपिन अभिकर्मक हैं। जैसे, 1,000 से अधिक हिस्टोइन पीटीएम-विशिष्ट एंटीबॉडी को क्रोमेटिन बायोकैमिस्ट्री अनुसंधान में उपयोग के लिए व्यावसायिक रूप से विकसित किया गया है। उच्च-थ्रुपुट डीएनए अनुक्रमण तकनीक के तेजी से विकास के साथ, इन अभिकर्मकों को अलग-अलग जांचकर्ताओं और बड़े पैमाने पर epigenomics "रोडमैप" पहल ( उदाहरण के लिए , एनकोड और BLUEPRINT) चिप-सेक में बड़े पैमाने पर उपयोग किया जा रहा है (अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के साथ मिलकर क्रोमैटिन प्रतिरक्षा ) पाइपलाइनों को हिस्टोन पीटीएम वितरण जीनोम चौड़ा 10 , 11 के उच्च-रिज़ॉल्यूशन स्पेसियल मैप्स उत्पन्न करने के लिए। हालांकि, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी की विशिष्टता बेहद चर हो सकती है और ये अभिकर्मक अप्रत्यक्ष प्रदर्शन कर सकते हैं। ऑफ-टावर एपेटोप मान्यता जैसे आकर्षक गुण, पड़ोसी पीटीएम द्वारा मजबूत सकारात्मक और नकारात्मक प्रभाव, और किसी विशेष अवशेष ( उदा । मोनो, डाय- या त्रि-मेथिलिलीन) , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 इसलिए, हिस्टोन PTM- विशिष्ट एंटीबॉडी अभिकर्मकों के सख्त गुणवत्ता नियंत्रण इन मूल्यवान अभिकर्मकों से उत्पन्न डेटा को सही ढंग से व्याख्या करने के लिए आवश्यक है।
माइक्रोएरे तकनीक एक उच्च-थ्रूपुट, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और लघुरूप प्रारूप में हजारों मैक्रोमोलेकुलर इंटरैक्शन के साथ-साथ पूछताछ के लिए सक्षम बनाता है। इस कारण से, विभिन्न प्रकार के माइक्रोएरे प्लेटफार्म प्रोटीन-डीएनए 1 9 का विश्लेषण करने के लिए बनाया गया है ,"20, प्रोटीन-प्रोटीन 21 , और प्रोटीन-पेप्टाइड इंटरैक्शन 22. दरअसल, हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे क्रोमेटिन बायोकैमिस्ट्री अनुसंधान के लिए एक जानकारीपूर्ण खोज मंच के रूप में उभरा है, जिससे लेखकों, ईरासर्स और हिस्टोन पीटीएम 15 के पाठकों की उच्च-थ्रुपुटप्रोफ़ाइलिंग को सक्षम किया जा सकता है , 23 , 24 और हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता 17 , 25 के विश्लेषण के लिए। क्रोमैटिन और एपिजेनेटिक्स रिसर्च में अपने आवेदन से परे, हिस्टोन पेप्टाइड एरेज़ में प्रणालीगत ल्यूपस एरिथेमेटोस और अन्य ऑटोइम्यूनस रोगों के लिए नैदानिक / क्रोमेटिन ऑटोटेनिबॉडीज 26 , 27 उत्पन्न होते हैं।
यहां, हम एक एकीकृत पाइपलाइन का वर्णन करते हैं जो हमने डिजाइनिंग, निर्माण, और क्यू के लिए विकसित किया हैएंटीबॉडी के लिए विशिष्टता प्रोफाइल बनाने के लिए हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरी का शिकार करना जो कि हिस्टोन और उनके पीटीएम को पहचानते हैं। ऐरेनिनजा द्वारा पाइपलाइन की सुविधा है, एक खुला स्रोत, इंटरैक्टिव सॉफ्टवेयर एप्लीकेशन जिसे हमने हाल ही में विकसित किया है, जो माइक्रोएरे प्रयोगों के डिजाइन और विश्लेषण चरणों को एकीकृत करता है 28 । ArrayNinja Google Chrome में सबसे अच्छा काम करता है संक्षेप में, एक रोबोट सम्पर्क माइक्रोएरे प्रिंटर स्ट्रेप्टिविन-लेपित ग्लास माइक्रोस्कोप स्लाइड्स पर परिभाषित पदों पर बायोटिन-संयुग्मित हिस्टोन पेप्टाइड्स के पुस्तकालय को जमा करने के लिए उपयोग किया जाता है। एंटेबॉडी-एपिटेप इंटरैक्शन ( चित्रा 1 ) से पूछताछ करने के लिए एरेज़ एक प्रतियोगी और समानांतर परख प्रारूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। पेप्टाइड पुस्तकालय में पीटीएम (अकेले लाइसिन एसिटिलेशन, लाइसिन / आर्गेनिन मेथिलैशन, और सेरीन / थ्रेऑनिन फॉस्फोरायलेशन) को सशक्त अद्वितीय सिंथेटिक पेप्टाइड्स होते हैं और प्रायोगिक डेटासेट्स से बड़े पैमाने पर प्रासंगिक संयोजनों में शामिल होते हैं। पेप्टाइड संश्लेषण और सत्यापन के लिए तरीके कहीं और 23 विस्तृत हैं हमारे मौजूदा हिस्टोन पीटीएम एंटीबॉडी स्क्रीनिंग प्रयासों से उत्पन्न इस सरणी मंच से उत्पन्न डेटा को सार्वजनिक वेब संसाधन, हिस्टोन एंटीबॉडी विशिष्टता डेटाबेस (www.histoneantibodies.com) पर संग्रहीत किया जाता है। विशेष रूप से, हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरेज़, इस प्रोटोकॉल के विविधताओं के साथ गढ़े हुए हैं, इसका इस्तेमाल हिस्टोन पीटीएम रीडर डोमेन 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 और हाल ही में प्रोफाइल हिस्टोन के लिए किया गया है। PTM लेखक और रबड़ की गतिविधियों 24
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चित्रा 1 चित्रा 1: एक हिस्टोन पेप्टाइड माइक्रोएरे पर एंटीबॉडी स्क्रीनिंग के लिए कदमवाही प्रक्रिया की कार्टून चित्रण। बायोटिनिलेटेड हिस्टोन पेप्टाइड्स परिभाषित पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी संशोधनों (लाल और नीले हलकों) को संरक्षित करते हैं जो स्ट्रैप्टिविंस-लेपित ग्लास पर बायोटिन-फ्लोरोसिसिन के साथ सह-मुद्रित होते हैं। सकारात्मक संपर्कों को लाल प्रतिदीप्ति के रूप में देखा जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें
Protocol
Representative Results
Discussion
जैव चिकित्सा अनुसंधान अनुप्रयोगों में एंटीबॉडी विश्वसनीयता सर्वोच्च 46 , 47 है । यह क्रोमेटिन बायोकैमिस्ट्री में विशेष रूप से सच है, जो कि हिस्टोन पीटीएम के बहुतायत और वितरण को चिह…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम वैन एन्डेल रिसर्च इंस्टीट्यूट और नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ हैल्थ (सीए 181343) से रिसर्च अनुदान के हिस्से में एसबीआर से समर्थित था
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
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