Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos
Summary
Este manuscrito descreve métodos para a aplicação de tecnologia de microarrays de péptidos para o perfil específico de anticorpos que reconhecem histonas e suas modificações pós-tradução.
Abstract
As modificações pós-translacionais (PTMs) nas proteínas das histonas são amplamente estudadas quanto aos seus papéis na regulação da estrutura da cromatina e da expressão gênica. A produção em massa e a distribuição de anticorpos específicos para as PTM das histonas facilitaram grandemente a pesquisa nessas marcas. Como os anticorpos PTM das histonas são reagentes-chave para muitas aplicações de bioquímica de cromatina, a análise rigorosa da especificidade do anticorpo é necessária para a interpretação precisa dos dados e o progresso contínuo no campo. Este protocolo descreve uma tubagem integrada para o projeto, fabricação e uso de microarrays de péptidos para perfilar a especificidade de anticorpos de histonas. Os aspectos de design e análise deste procedimento são facilitados pelo ArrayNinja, um pacote de software de código aberto e interativo desenvolvido recentemente para simplificar a personalização de formatos de impressão em microarray. Este pipeline foi usado para exibir um grande número de antibióticos de histona PTM, amplamente utilizados e comercializados.S, e os dados gerados a partir dessas experiências estão disponíveis gratuitamente através de um banco de dados de especificações de anticorpos de histona online e em expansão. Além das histonas, a metodologia geral aqui descrita pode ser aplicada amplamente à análise de anticorpos específicos de PTM.
Introduction
O DNA genômico é embalado elegantemente dentro do núcleo da célula eucariótica com proteínas histonas para formar cromatina. A subunidade de repetição da cromatina é o nucleossoma, que consiste em 147 pares de bases de DNA envolvidos em torno de um núcleo octamerico de proteínas histonas – H2A, H2B, H3 e H4 1 . A cromatina é amplamente organizada em eucromatina vagamente compactada e domínios de heterocromatina bem embalados. O grau de compactação da cromatina regula a medida em que as máquinas de proteínas podem acessar o DNA subjacente para realizar processos fundamentais de DNA, tais como replicação, transcrição e reparo.
Os principais reguladores da acessibilidade do genoma no contexto da cromatina são PTMs na cauda não estruturada e nos domínios principais das proteínas das histonas 2 , 3 . Os PTM Histone funcionam diretamente influenciando a estrutura da cromatina 4 e indiretamente através daH o recrutamento de proteínas leitoras e seus complexos macromoleculares associados que possuem atividades de remodelação da cromatina, enzima e andaimes 5 . Estudos sobre a função das histonas PTM nas últimas duas décadas sugerem esmagadoramente que essas marcas desempenham papéis fundamentais na regulação do destino das células, do desenvolvimento organizacional e da iniciação / progressão da doença. Alimentado pelos avanços na tecnologia proteômica baseada em espectrometria de massa, foram descobertas mais de 20 PTM de histonas únicas em mais de 80 resíduos de histonas distintas 6 . Notavelmente, essas modificações geralmente ocorrem em combinações e consistentes com a hipótese do "código histônico", numerosos estudos sugerem que as proteínas leitoras são direcionadas para regiões discretas de cromatina através do reconhecimento de combinações específicas de histonas PTM 7 , 8 , 9 . Um desafio chave para avançar será atribuir funções ao grDevido a lista de PTM de histonas e para determinar como combinações específicas de PTM de histonas orquestra as funções dinâmicas associadas à cromatina.
Os anticorpos são os reagentes lynchpin para a detecção de PTM de histonas. Como tal, mais de 1.000 anticorpos específicos de PTM de histonas foram comercialmente desenvolvidos para uso em pesquisa de bioquímica de cromatina. Com o rápido desenvolvimento da tecnologia de sequenciação de DNA de alto rendimento, esses reagentes estão sendo amplamente utilizados por pesquisadores individuais e iniciativas de "roteiro" de epigenômica em larga escala ( por exemplo , ENCODE e BLUEPRINT) em ChIP-seq (imunoprecipitação de cromatina, juntamente com sequenciação da próxima geração ) Pipelines para gerar mapas espaciais de alta resolução da distribuição de histonas PTM em todo o genoma 10 , 11 . No entanto, estudos recentes mostraram que a especificidade dos anticorpos PTM das histonas pode ser altamente variável e que esses reagentes exibem falta Propriedades avoráveis, como o reconhecimento do epitopo fora do alvo, forte influência positiva e negativa dos PTM vizinhos e dificuldade em discriminar a ordem de modificação sobre um resíduo particular ( por exemplo , mono-, di- ou trimetilisina) 12 , 13 , 14 , 15 , 16, 17, 18. Portanto, o controle de qualidade rigoroso dos reagentes de anticorpos específicos de PTM de histonas é necessário para interpretar com precisão os dados gerados com esses reagentes valiosos.
A tecnologia Microarray permite a interrogação simultânea de milhares de interações macromoleculares em um formato de alto rendimento, reprodutível e miniaturizado. Por esta razão, uma variedade de plataformas de microarray foram criadas para analisar proteína-DNA 19 ,", 20, proteína-proteína 21 e interações proteína-péptido 22. Na verdade, as microarrays de péptidos de histonas emergiram como uma plataforma de descoberta informativa para pesquisa de bioquímica de cromatina, permitindo o perfil de alto rendimento dos escritores, borrachas e leitores de histonas PTMs 15 , 23 , 24 e também para a análise da especificidade do anticorpo das histonas 17 , 25. Além da sua aplicação na pesquisa de cromatina e epigenética, os arrays de péptidos de histona possuem utilidade potencial como teste diagnóstico / prognóstico para lúpus eritematoso sistêmico e outras doenças autoimunes em que os anticorpos anti- Os autoanticorpos da cromatina são gerados 26 , 27 .
Aqui, descrevemos um pipeline integrado que desenvolvemos para projetar, fabricar e queGerando microarrays de péptidos de histona para gerar perfis de especificidade para anticorpos que reconhecem histonas e seus PTMs. O pipeline é facilitado pela ArrayNinja, uma aplicação de software de código aberto e interativa que desenvolvemos recentemente, que integra os estágios de design e análise das experiências de microarrays 28 . ArrayNinja funciona melhor no Google Chrome. Resumidamente, uma impressora de microarray de contato robotizado é usada para depositar uma biblioteca de péptidos de histona conjugados com biotina em posições definidas em lâminas de microscópio de vidro revestidas com estreptavidina. As matrizes podem então ser usadas em um formato de ensaio competitivo e paralelo para interrogar interações anticorpo-epítopo ( Figura 1 ). A biblioteca de péptidos consiste em centenas de péptidos sintéticos únicos que abrigam PTMs (acetilação de lisina, metilação de lisina / arginina e fosforilação de serina / treonina) e em combinações relevantes em grande parte derivadas de conjuntos de dados proteômicos. Métodos para síntese e validação de péptidos São detalhados em outro lugar 23 . Os dados gerados a partir dos nossos atuais esforços de rastreamento de anticorpos de PTM de histonas utilizando esta plataforma de matriz são arquivados em um recurso público da Web, a Histone Antibody Specificity Database (www.histoneantibodies.com). Notavelmente, as microarrays de péptidos de histonas fabricadas com variações deste protocolo também foram utilizadas amplamente para caracterizar a atividade dos domínios de leitor PTM de histona 8 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36 , 37 e, mais recentemente, para histona de perfil Atividades de gravador e borracha PTM 24 .
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Figura 1: Desenho dos desenhos animados do procedimento Stepwise para triagem de anticorpos em um microarray de péptido de histona. Os péptidos de histona biotinilados que abrigam modificações pós-translacionais definidas (círculos vermelho e azul) são co-impressos com biotina-fluoresceína em vidro revestido com estreptavidina. As interações positivas são visualizadas como fluorescência vermelha. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
A confiabilidade de anticorpos em aplicações de pesquisa biomédica é primordial 46 , 47 . Isto é especialmente verdadeiro na bioquímica da cromatina, dada a posição dos anticorpos como ferramentas-chave para a maioria das técnicas desenvolvidas para caracterizar a abundância e distribuição de PTM de histonas. O protocolo apresentado aqui detalha um pipeline otimizado para o projeto, fabricação e uso de microarrays de péptidos para analisar a espec…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado em parte pelo Van Andel Research Institute e uma bolsa de pesquisa dos Institutos Nacionais de Saúde (CA181343) para SBR
Materials
| Printing Buffer | ArrayIt | PPB | |
| BSA | Omnipure | 2390 | |
| Streptavidin-coated glass microscope slides | Greiner Bio-one | 439003-25 | |
| polypropylene 384 well plate | Greiner Bio-one | 784201 | |
| Biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | |
| contact microarray printer | Aushon | 2470 | Aushon 2470 Microarray Printer |
| contact microarray printer | Gene Machines | OmniGrid 100 | OmniGrid Microarray Printer |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Blocking Buffer | ArrayIt | SBB | |
| Hydrophobic wax pen | Vector Labs | H-4000 | ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen |
| Silicon Gasket | Grace Bio-labs | 622511 | |
| Hybridization Vessel | Thermo Scientific | 267061 | or similar vessel |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21244 | Alexa Fluor 647 (anti-rabbit) |
| Fluorescent-dye conjugated secondary antibody | Life Technologies | A-21235 | Alexa Fluor 647 (anti-mouse) |
| Wax Imprinter | ArrayIt | MSI48 | |
| Tween-20 | Omnipure | 9490 | |
| Microarray Scanner | Innopsys | InnoScan 1100AL | or equivalent microarray scanner |
| EipTitan Histone Peptide Microarray | Epicypher | 112001 | |
| AbSurance Pro Histone Peptide Microarray | Millipore | 16668 | |
| MODified Histone Peptide Array | Active Motif | 13001 | |
| Histone Code Peptide Microarrays | JPT | His_MA_01 | |
| Wax | Royal Oak | GulfWax | for wax imprinter |
| Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber | VWR | 97000-284 | |
| High throughput microscope slide washing chamber | ArrayIt | HTW | |
| Microscope slide centrifuge | VWR | 93000-204 | |
| Antibody 1 | Abcam | 8898 | |
| Antibody 2 | Millipore | 07-473 | |
| Biotinylated histone peptide | EpiCypher | 12-0001 | Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources. |
| ImageMagick | https://www.imagemagick.org/script/index.php | ||
| ArrayNinja | https://rothbartlab.vai.org/tools/ |
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