JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Medicine

Investigando a von Willebrand Factor fisiopatologia usando um modelo de câmara de fluxo de von Willebrand Factor-plaquetas String formação

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/55917
, , , ,
1Department of Pathology and Molecular Medicine,Queen’s University, 2Department of Medicine,Queen’s University

Summary

Neste trabalho, descrevemos um método para avaliar endotelial von Willebrand fator liberação e as plaquetas subsequentes capturam sob tensão de cisalhamento de fluido em resposta a estímulos inflamatórios, usando um sistema de câmara de fluxo em vitro .

Abstract

Fator de von Willebrand (VWF) é um fator de coagulação multiméricas glicoproteína que medeia adesão plaquetária e agregação em locais de dano endotelial e que transporta o fator VIII na circulação. VWF é sintetizada pelas células endoteliais e também é lançado constitutivamente para o plasma ou é armazenada em organelas especializadas, chamadas corpos de Weibel-Palade (WPBs), para a liberação sob demanda em resposta ao desafio hemostática. Procoagulante e proinflammatory estímulos podem induzir rapidamente exocitose WPB e lançamento do VWF. A maioria de VWF liberado pelas células endoteliais circula no plasma; no entanto, uma proporção de VWF é ancorada à superfície da célula endotelial. Sob condições de cisalhamento fisiológica, VWF ancorada endotelial pode vincular a plaquetas, formando uma cadeia de caracteres de VWF-plaquetas que pode representar o nicho da formação de trombos. Um sistema de câmara de fluxo pode ser usado para observar visualmente a liberação de VWF de células endoteliais e a subsequente plaqueta de capturar em uma maneira que seja reprodutível e relevantes para a fisiopatologia da formação de trombos VWF-mediada. Usando esta metodologia, as células endoteliais são cultivadas em uma câmara de fluxo e são posteriormente estimuladas com secretagogues de induzir exocitose WPB. As plaquetas lavadas então são pintadas sobre o endotélio ativado. As plaquetas são ativadas e posteriormente ligam a sequências VWF alongadas na direção do fluxo do fluido. Usando os histones extracelulares como um estímulo procoagulante e proinflammatory, observamos maior formação de sequência de caracteres VWF-plaquetas células endoteliais histona-tratadas em comparação com as células endoteliais não tratadas. Este protocolo descreve uma avaliação quantitativa, visual e em tempo real da ativação de interações VWF-plaquetas em modelos de trombose e hemostasia.

Introduction

Trombose é a principal causa de mortalidade no mundo1 e pode se desenvolver em resposta todysregulated plaquetária ativação e trombina geração em ambas as artérias veinsand. Os níveis plasmáticos de VWF são um regulador chave de coagulação do sangue, segundo o qual a níveis baixos (< 50%) resultar no distúrbio hemorrágico, conhecido como von Willebrand (VWD) de doença2 e níveis elevados (> 150%) estão associados com um risco aumentado de venosa3 e trombose arterial4 .

VWF é uma glicoproteína multiméricas sintetizada pelos megacariócitos e células endoteliais e armazenado em plaquetas α-grânulos e WPBs, respectivamente. Desafio hemostático, VWF pode ser liberado da endoteliais WPBs para amarrar as plaquetas circulantes de células endoteliais ativadas5 ou colágeno exposto no vaso parede6. Ancoragem de VWF para células endoteliais foi mostrado para ser mediado pelo P-selectina7 e integrinas αvβ38. A subsequente liberação de plaquetas α-grânulo lojas pode aumentar ainda mais as concentrações de VWF localizadas para estabilizar as interações de plaquetas-plaquetas para a formação de plaquetas plug, o andaime necessário para a propagação da cascata de coagulação e fibrina deposição. A atividade de plaquetas-ligação do VWF é regulada pela sua estrutura multiméricas, com oriundas de alto peso molecular, possuindo maior atividade hemostática9,10. Em circulação, VWF também atua como um portador para o factor VIII de coagulação.

Tensão de cisalhamento de fluido é um regulador essencial da fisiologia do VWF. Na ausência de tensão de cisalhamento, VWF existe sob uma forma globular, ocultando os domínios de ligação para a glicoproteína plaquetária Ib adesão11. Quando a tensão de cisalhamento está presente, o local de clivagem para uma metalloprotease, uma Desintegrina e metalloprotease com motivo thrombospondin (ADAMTS13), é exposto. ADAMTS13 cliva nuas e plaquetas-decorado VWF sequências de caracteres para regular o tamanho do multimer, reduzindo sua atividade hemostática12.

VWF é uma proteína de fase aguda, e inúmeros estímulos, incluindo hipoxia13, infecção14e cytokines proinflammatory, foram mostrados para mediar a liberação VWF de células endoteliais. Semelhante a outros agentes inflamatórios, histonas extracelulares também foram mostrados para induzir liberação sistêmica de VWF ratos15,16 e a ativação de plaquetas em vitro17,18, 19. isto foi mostrado para ser dependente de subtipo de histona, como diferenças de lisina e conteúdo de arginina pode influenciar a função15. Nossa estudo visa estabelecer uma câmara de fluxo modelo para investigar a influência do rico em lisina (HK) e ricos em arginina subtipos de histona (HR) e secretagogues na liberação VWF endotelial e plaquetária em tempo real de captura, potenciais eventos precoce em trombose induzida por inflamação.

Esta metodologia de câmara de fluxo recapitula em vivo de interações entre as plaquetas, células endoteliais, VWF e colágeno subendotelial em um sistema em vitro que é visual, reprodutível e quantificáveis. Permite a avaliação em tempo real de todos os aspectos do percurso que regula as interações VWF-plaquetas, incluindo secreção WPB, Ativação plaquetária e proteólise VWF. Estudos de VWF sob condições controladas de tensão de cisalhamento têm sido utilizados para avaliar as mutações do VWD que prejudicam a liberação do VWF e plaqueta-ligação função20, WPB fisiologia21e clivagem VWF por ADAMTS135. Nós usamos esta metodologia para quantificar a formação de cadeia de caracteres VWF-plaquetas como consequência de um estímulo inflamatório: histonas extracelulares.

Protocol

Estes estudos foram aprovados pelo University, Canadá da investigação ética Board da rainha. 1. endothelial da pilha estimulação Uma placa de cultura de tecidos de 6-poços de colágeno-casaco. 24 h de antecedência, casaco, uma placa de cultura de tecidos de 6-poços em 37 ° C, com 1 mL de colágeno de buffer (50 µ g/mL rato cauda colágeno tipo 1 com 0,02 M de ácido acético glacial). Lave os poços duas vezes com 2 mL de Hank está e…

Representative Results

Para avaliar diretamente o efeito das histonas na liberação VWF de células endoteliais, estamos expostos a confluentes BOECs de PMA contendo soro livre médio (controle positivo), UH, HR e HK por 2 h. Nós mostramos que a HK induziu um aumento de 2 vezes em proteínas VWF (VWFAg) no meio de células endoteliais expostas (Figura 1). Curiosamente, quando BOECs foram estimulados com UH e RH, lá era menos VWFAg detectado no meio do que na condição de não t…

Discussion

Enquanto a relevância fisiológica do VWF-plaquetas cordas permanece controverso devido a sua rápida dissolução na presença da VWF-cleaving protease ADAMTS13, eles servem como um modelo quantificável em vitro de recrutamento de plaquetas pelo VWF para um site em que um trombo pode formar na presença de localizadas aumentos nos níveis de histona5. Além disso, em patologias falta ADAMTS13 atividade-tais como púrpura trombocitopênica trombótica (PTT) – ou no microambiente inflama…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alison Michels é um destinatário de um Frederick Banting e Charles Best Canadá graduação bolsa de institutos canadenses da pesquisa saúde (CIHR). Laura L. Swystun é o destinatário de uma comunhão CIHR. David Lillicrap é o destinatário de uma cadeira de pesquisa do Canadá na hemostase Molecular. Este estudo foi financiado em parte por um CIHR grant (MOP-97849) de funcionamento.

Materials

Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, a. B., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel – Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend’homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Von Willebrand FactorVWF-platelet String FormationFlow Chamber ModelCollagenEndothelial CellsPlateletsSecretagoguesIn VitroMicroscopySyringe Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image