JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Medicine

Enquêter sur von Willebrand facteur physiopathologie en utilisant un modèle de chambre d’écoulement de von Willebrand Factor-plaquettes String Formation

Published: August 14, 2017
doi:
10.3791/55917
, , , ,
1Department of Pathology and Molecular Medicine,Queen’s University, 2Department of Medicine,Queen’s University

Summary

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour évaluer endothéliales von Willebrand libération du facteur et les plaquettes suivantes de saisie sous la contrainte de cisaillement fluide en réponse à des stimuli inflammatoires à l’aide d’un système de chambre in vitro flux.

Abstract

Le facteur von Willebrand (VWF) est un facteur de coagulation de glycoprotéine multimère qui intervient dans l’adhésion des plaquettes et agrégation sur les sites des lésions endothéliales et qui transporte le facteur VIII dans la circulation. VWF est synthétisé par les cellules endothéliales et est libéré soit constitutivement dans le plasma ou est stocké dans des organites spécialisés, appelés corps de Weibel-Palade (WPBs), à la demande de libération en réponse au défi hémostatique. Procoagulant et pro-inflammatoires des stimuli peuvent induire rapidement l’exocytose WPB et libération VWF. La majorité du VWF libéré par les cellules endothéliales circule dans le plasma ; Toutefois, une proportion de VWF est ancrée à la surface des cellules endothéliales. Dans des conditions de cisaillement physiologique, endothéliales ancrées VWF peut lier aux plaquettes, formant une chaîne de VWF-plaquettaire qui peut-être représenter le nidus de la formation du thrombus. Un système de chambre de flux permet d’observer visuellement la libération de VWF des cellules endothéliales et les plaquettes ultérieures capturer de manière reproductible et adaptée à la physiopathologie de la formation du thrombus par l’intermédiaire du VWF. En utilisant cette méthode, les cellules endothéliales sont cultivés dans une chambre à flux et sont stimulés par la suite avec les sécrétagogues induire l’exocytose WPB. Plaquettes lavées sont ensuite perfusés sur l’endothélium activé. Les plaquettes sont activés et par la suite se lient à des chaînes de VWF allongées dans le sens d’écoulement du fluide. Utilisant des histones extracellulaires comme un stimulus procoagulant et pro-inflammatoires, nous avons observé de formation de chaîne de VWF-plaquettes accrue sur les cellules endothéliales histone traités par rapport aux cellules endothéliales non traitées. Ce protocole décrit une évaluation quantitative et visuelle en temps réel de l’activation des interactions de VWF-plaquettes dans des modèles de thrombose et hémostase.

Introduction

La thrombose est des principales causes de mortalité dans le monde1 et peut se développer en réponse todysregulated plaquettaire d’activation et de thrombine génération dans les deux artères veinsand. Des niveaux de plasma de VWF sont un régulateur clé de coagulation du sang, auquel cas les niveaux bas (< 50 %) causer le trouble de la coagulation dite von Willebrand disease (maladie de von Willebrand)2 et niveaux élevés (> 150 %) sont associés à un risque accru de veineux3 et thrombose artérielle4 .

VWF est une glycoprotéine multimère synthétisée par les cellules endothéliales et les mégacaryocytes et stockées dans les granules α plaquettaire et WPBs, respectivement. Après provocation hémostatique, VWF peut être libéré de WPBs endothéliales pour attacher des plaquettes circulantes des cellules endothéliales activées5 ou collagène exposée sur le mur de navire6. Ancrage du VWF aux cellules endothéliales s’est avéré être médiée par la P-sélectine7 et intégrine αvβ38. La libération subséquente de plaquettes granules α magasins pouvez encore accroître les concentrations de VWF localisées pour stabiliser les interactions plaquettes plaquettes pour la formation de bouchon plaquettaire, l’échafaudage nécessaire pour la propagation de la cascade de coagulation et de la fibrine dépôts. L’activité de liaison plaquettaire du VWF est régie par sa structure multimériques, avec multimères de poids moléculaire élevé possédant une plus grande activité hémostatique9,10. En circulation, le VWF agit également comme un support pour le facteur VIII de coagulation.

Fluide de cisaillement est un régulateur essentiel de la physiologie VWF. En l’absence de contrainte de cisaillement, VWF existe sous une forme globulaire, dissimulant des domaines de liaison pour la glycoprotéine plaquettaire Ib adhérence11. Lorsque la contrainte de cisaillement est présente, le site de clivage pour une métalloprotéase, un disintegrin et métalloprotéase avec motif thrombospondine (ADAMTS13), est exposé. ADAMTS13 Clive chaînes VWF nues et décorés en plaquettes pour réguler la taille des multimères, réduisant ainsi son activité hémostatique12.

VWF est une protéine de phase aiguë, et de nombreux stimuli, notamment hypoxie13infection14et des cytokines pro-inflammatoires, auraient dû être divulgués à la médiation de sortie VWF des cellules endothéliales. Semblable à d’autres agents inflammatoires, histones extracellulaires ont également montrés pour induire la libération systémique de VWF souris15,16 et l’activation des plaquettes in vitro17,18, 19. cela a été montré à dépendre de sous-type d’histone, que les différences en lysine et teneur en arginine peut influencer la fonction15. Notre étude vise à établir une chambre à flux modèle pour étudier l’influence des riches en lysine (HK) et riches en arginine sous-types d’histone (HR) et sécrétagogues sur des rejets VWF endothéliales et des plaquettes en temps réel de capture, éventuels événements précoces l’inflammation induite par la thrombose.

Cette méthodologie de chambre de flux récapitule en vivo interactions entre collagène sous-endothélial, cellules endothéliales, du VWF et plaquettes dans un système in vitro qui est visuel, reproductible et quantifiables. Il permet l’évaluation en temps réel de tous les aspects de la voie qui régule les interactions du VWF-plaquettes, dont la sécrétion WPB, l’activation plaquettaire et protéolyse VWF. Études de VWF dans des conditions contrôlées de cisaillement ont été utilisés pour évaluer les mutations VWD qui nuisent communiqué de VWF et plaquettes-liaison fonction20, WPB physiologie21et clivage VWF par ADAMTS135. Nous utilisons cette méthode pour quantifier la formation de chaîne de VWF-plaquettes suite à un stimulus inflammatoire : histones extracellulaires.

Protocol

Ces études ont été approuvées par University, au Canada Research Ethics Board de la Reine. 1. endothélial Stimulation Collagène-manteau une plaque 6 puits culture de tissus. 24h à l’avance, manteau une plaque 6 puits tissue culture à 37 ° C avec 1 mL de collagène de la mémoire tampon (50 µg/mL rat queue du collagène de type 1 avec l’acide acétique glacial 0,02 M). Laver les puits deux fois avec 2 mL de Hank Balanced Salt Soluti…

Representative Results

Pour évaluer directement l’effet des histones sur la libération VWF de cellules endothéliales, nous avons exposé BOECs anastomosés au milieu sans sérum contenant PMA (contrôle positif), UH, RH et HK pendant 2 h. Nous avons montré que HK a induit une augmentation de 2 fois en protéines VWF (VWF:Ag) au milieu des cellules endothéliales traitées (Figure 1). Fait intéressant, lorsque BOECs sont stimulées avec UH et RH, il a été moins VWF:Ag déte…

Discussion

Alors que la pertinence physiologique de VWF-plaquettes cordes reste controversé en raison de leur dissolution rapide en présence de la protéase clivant de VWF ADAMTS13, ils servent de modèle quantifiables in vitro du recrutement de plaquettes de VWF vers un site au qui un thrombus peut former en présence de localisé des augmentations histone niveaux5. En outre, dans les pathologies dénuées d’ADAMTS13 telle activité comme le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTT) – ou d…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Alison Michels est un destinataire de Frederick Banting et Charles Best Canada Bourse d’études supérieures de l’instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Laura L. Swystun a reçu une bourse des IRSC. David Lillicrap est le récipiendaire d’une Chaire de recherche du Canada en hémostase moléculaire. Cette étude a été financée en partie par une subvention (MOP-97849) de fonctionnement des IRSC.

Materials

Calf-thymus unfractionated histones (UH) Worthington Biochemical HLY Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus lysine-rich histones (HK) Sigma-Aldrich H5505 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Calf-thymus arginine-rich histones (HR) Sigma-Aldrich H4830 Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) Sigma-Aldrich P8139 Reconstituted in DMSO (20 mM)
Histamine Sigma-Aldrich H7125-1G Reconstituted in water (50 mg/mL)
3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) Invitrogen D273 Reconstituted in methanol (20 mM)
Rabbit Anti-VWF Coating Antibody DAKO A0082 For VWF ELISA
Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated DAKO P0026 For VWF ELISA and histone-VWF binding assay
Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates eBioscience 44-2404-21 For histone-VWF binding assay
Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates Thermo Scientific 3855 For VWF ELISA
Humate-P CSL Behring N/A Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex
Normal Reference Plasma Precision BioLogic CCNRP-05 For VWF ELISA standard curve
O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent Sigma-Aldrich P8287 Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)
EGM-2 BulletKit Lonza CC-3162 For culturing and initial seeding of BOEC
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) ThermoFisher Scientific 14025092
Rat-tail Collagen Type 1 Corning 354236
Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media ThermoFisher Scientific 31985070 For endothelial cell stimulations
METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software Molecular Devices N/A
BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive BD Biosciences 366703
µ-Slide III 0.1 (flow chambers) Ibidi This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2
Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized Ibidi 10842
Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized Ibidi 10825
Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized Ibidi 10802
Blunted 18G Needle BD Biosciences 305180
20 mL syringes BD Biosciences 302830
Syringe Pump New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM N/A
Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope Quorum Technologies N/A
Image Processing Software ImageJ N/A
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Roger, V. L., et al. Heart disease and stroke statistics–2011 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 123 (4), e18-e209 (2011).
  2. Sadler, J. E. von Willebrand factor: two sides of a coin. J Thromb Haemost. 3 (8), 1702-1709 (2005).
  3. Koster, T., Blann, A. D., Briët, E., Vandenbroucke, J. P., Rosendaal, F. R. Role of clotting factor VIII in effect of von Willebrand factor on occurrence of deep-vein thrombosis. Lancet. 345 (8943), 152-155 (1995).
  4. Morange, P. E., et al. Endothelial Cell Markers and the Risk of Coronary Heart Disease: The Prospective Epidemiological Study of Myocardial Infarction (PRIME) Study. Circulation. 109 (11), 1343-1348 (2004).
  5. Dong, J. F., et al. ADAMTS-13 rapidly cleaves newly secreted ultralarge von Willebrand factor multimers on the endothelial surface under flowing conditions. Blood. 100 (12), 4033-4039 (2002).
  6. Ruggeri, Z. M. Von Willebrand factor, platelets and endothelial cell interactions. J Thromb Haemost. 1 (7), 1335-1342 (2003).
  7. Padilla, A., et al. P-Selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface P-selectin anchors newly released ultralarge von Willebrand factor multimers to the endothelial cell surface. Blood. 103 (6), 2150-2156 (2004).
  8. Huang, J., Roth, R., Heuser, J. E., Sadler, J. E. Integrin alpha v beta 3 on human endothelial cells binds von Willebrand factor strings under fluid shear stress. Blood. 113 (7), 1589-1598 (2009).
  9. Moake, J. L., Turner, N. A., Stathopoulos, N. A., Nolasco, L. H., Hellums, J. D. Involvement of large plasma von Willebrand Factor (vWF) multimers and unusually large vWF forms derived from endothelial cells in shear stress-induced platelet aggregation. J Clin Invest. 78 (6), 1456-1461 (1986).
  10. Federici, a. B., Bader, R., Pagani, S., Colibretti, M. L., De Marco, L., Mannucci, P. M. Binding of von Willebrand factor to glycoproteins Ib and IIb/IIIa complex: affinity is related to multimeric size. Br J Haematol. 73, 93-99 (1989).
  11. Goto, S., Salomon, D. R., Ikeda, Y., Ruggeri, Z. M. Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willebrand Factor to Platelets Characterization of the Unique Mechanism Mediating the Shear-dependent Binding of Soluble von Willeb. J Biol Chem. 270 (40), 23352-23361 (1995).
  12. Shim, K., Anderson, P. J., Tuley, E. A., Wiswall, E., Sadler, J. E. Platelet-VWF complexes are preferred substrates of ADAMTS13 under fluid shear stress. Blood. 111 (2), 651-657 (2008).
  13. Pinsky, D. J., et al. Hypoxia-induced exocytosis of endothelial cell weibel-palade bodies: A mechanism for rapid neutrophil recruitment after cardiac preservation. J Clin Invest. 97 (2), 493-500 (1996).
  14. Luttge, M., et al. Streptococcus pneumoniae induces exocytosis of Weibel-Palade bodies in pulmonary endothelial cells. Cell Microbiol. 14 (2), 210-225 (2012).
  15. Michels, A., et al. Histones link inflammation and thrombosis through the induction of Weibel – Palade body exocytosis. J Thromb Haemost. 14 (11), 2274-2286 (2016).
  16. Brill, A., et al. Neutrophil extracellular traps promote deep vein thrombosis in mice. J Thromb Haemost. 10 (1), 136-144 (2012).
  17. Semeraro, F., et al. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2. Blood. 118 (7), 1952-1961 (2011).
  18. Ammollo, C. T., Semeraro, F., Xu, J., Esmon, N. L., Esmon, C. T. Extracellular histones increase plasma thrombin generation by impairing thrombomodulin-dependent protein C activation. J Thromb Haemost. 9 (9), 1795-1803 (2011).
  19. Carestia, A., Rivadeneyra, L., Romaniuk, M. A., Fondevila, C., Negrotto, S., Schattner, M. Functional responses and molecular mechanisms involved in histone-mediated platelet activation. Thromb Haemost. 110 (5), 1035-1045 (2013).
  20. Wang, J. W., et al. Analysis of the storage and secretion of von Willebrand factor in blood outgrowth endothelial cells derived from patients with von Willebrand disease. Blood. 121 (14), 2762-2772 (2013).
  21. Ferraro, F., et al. Weibel-Palade body size modulates the adhesive activity of its von Willebrand Factor cargo in cultured endothelial cells. Sci Rep. 6, 32473 (2016).
  22. Starke, R. D., et al. Cellular and molecular basis of von Willebrand disease: studies on blood outgrowth endothelial cells. Blood. 121 (14), 2773-2784 (2013).
  23. Ormiston, M. L., et al. Generation and Culture of Blood Outgrowth Endothelial Cells from Human Peripheral Blood. J Vis Exp. (106), e53384 (2015).
  24. Xu, J., et al. Extracellular histones are major mediators of death in sepsis. Nat Med. 15 (11), 1318-1321 (2009).
  25. Abrams, S. T., et al. Circulating histones are mediators of trauma-associated lung injury. Am J Respir Crit Care Med. 187 (2), 160-169 (2013).
  26. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Choi, H., Moake, J. L., Dong, J. F. Platelets adhered to endothelial cell-bound ultra-large von Willebrand factor strings support leukocyte tethering and rolling under high shear stress. J Thromb Haemost. 3 (3), 562-570 (2005).
  27. Hewlett, L., et al. Temperature-dependence of weibel-palade body exocytosis and cell surface dispersal of von willebrand factor and its propolypeptide. PLoS ONE. 6 (11), (2011).
  28. Lam, F. W., Cruz, M. A., Parikh, K., Rumbaut, R. E. Histones stimulate von Willebrand factor release in vitro and in vivo. Haematologica. 101 (7), e277-e279 (2016).
  29. Zheng, Y., Chen, J., López, J. A. Flow-driven assembly of VWF fibres and webs in in vitro microvessels. Nat Commun. 6 (7858), (2015).
  30. Ward, C. M., Tetaz, T. J., Andrews, R. K., Berndt, M. C. Binding of the von Willebrand factor A1 domain to histone. Thromb Res. 86 (6), 469-477 (1997).
  31. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand-factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  32. De Ceunynck, K., De Meyer, S. F., Vanhoorelbeke, K. Unwinding the von Willebrand factor strings puzzle. Blood. 121 (2), 270-277 (2013).
  33. Petri, B., et al. von Willebrand factor promotes leukocyte extravasation. Blood. 116 (22), 4712-4719 (2010).
  34. Aird, W. C. Endothelial cell heterogeneity. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), 1-13 (2012).
  35. Wang, J. W., et al. Formation of platelet-binding von Willebrand factor strings on non-endothelial cells. J Thromb Haemost. 10 (10), 2168-2178 (2012).
  36. Yamamoto, K., de Waard, V., Fearns, C., Loskutoff, D. J. Tissue Distribution and Regulation of Murine von Willebrand Factor Gene Expression In Vivo. Blood. 92 (8), 2791-2801 (1998).
  37. Shahani, T., Lavend’homme, R., Luttun, A., Saint-Remy, J. M., Peerlinck, K., Jacquemin, M. Activation of human endothelial cells from specific vascular beds induces the release of a FVIII storage pool. Blood. 115 (23), 4902-4909 (2010).
  38. Wu, S., et al. CaV3.1 (α1G) T-type Ca2+ channels mediate vaso-occlusion of sickled erythrocytes in lung microcirculation. Circ Res. 93 (4), 346-353 (2003).
  39. Knop, M., Gerke, V. Ca2+ -regulated secretion of tissue-type plasminogen activator and von Willebrand factor in human endothelial cells. Biochim Biophys Acta. 1600 (1-2), 162-167 (2002).
  40. Vischer, U., Wollheim, C. Epinephrine induces von Willebrand factor release from cultured endothelial cells: involvement of cyclic AMP-dependent signalling in exocytosis. Thromb Haemost. 77 (6), 1182-1188 (1997).
  41. Bernardo, A., Ball, C., Nolasco, L., Moake, J. F., Dong, J. F. Effects of inflammatory cytokines on the release and cleavage of the endothelial cell-derived ultralarge von Willebrand factor multimers under flow. Blood. 104 (1), 100-106 (2004).
  42. Kumar, R. A., Dong, J. F., Thaggard, J. A., Cruz, M. A., López, J. A., McIntire, L. V. Kinetics of GPIbalpha-vWF-A1 tether bond under flow: effect of GPIbalpha mutations on the association and dissociation rates. Biophys J. 85 (6), 4099-4109 (2003).
  43. Lipowsky, H. H., Usami, S., Chien, S. In vivo measurements of "apparent viscosity" and microvessel hematocrit in the mesentery of the cat. Microvasc Res. 19 (3), 297-319 (1980).
  44. De Ceunynck, K., et al. Local elongation of endothelial cell-anchored von Willebrand factor strings precedes ADAMTS13 protein-mediated proteolysis. J Biol Chem. 286 (42), 36361-36367 (2011).
  45. Coburn, L. A., Damaraju, V. S., Dozic, S., Eskin, S. G., Cruz, M. A., McIntire, L. V. GPIbalpha-vWF rolling under shear stress shows differences between type 2B and 2M von Willebrand disease. Biophys J. 100 (2), 304-312 (2011).
  46. Dong, J. F., et al. Magnesium maintains endothelial integrity, up-regulates proteolysis of ultra-large von Willebrand factor, and reduces platelet aggregation under flow conditions. Thromb Haemost. 99 (3), 586-593 (2008).

Tags

Von Willebrand FactorVWF-platelet String FormationFlow Chamber ModelCollagenEndothelial CellsPlateletsSecretagoguesIn VitroMicroscopySyringe Pump

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Michels, A., Swystun, L. L., Mewburn, J., Albánez, S., Lillicrap, D. Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation. J. Vis. Exp. (126), e55917, doi:10.3791/55917 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image