조사 폰 Willebrand 요소 이상 모델을 사용 하는 흐름 챔버의 폰 Willebrand 요인-혈소판 문자열 형성
Summary
이 문서에서 설명 하는 내 피 폰 Willebrand 평가 하는 방법 요소 릴리스 및 다음 혈소판 유체 전단 응력은 생체 외에서 흐름 챔버 시스템을 사용 하 여 염증 성 자극에 대 한 응답에서에서 캡처.
Abstract
폰 Willebrand 인자 (VWF) multimeric 당단백질 응고 요소를 혈소판 접착 력 및 내 피 손상의 사이트에서 집계 하는 중재 하 고 그 순환에 VIII 인자 이다. VWF 내 피 세포에 의해 합성 플라즈마에 constitutively 발표 하거나 또는 hemostatic 도전 하 응답에 온 디맨드 출시 Weibel Palade 시체 (WPBs) 라는 특수 세포에 저장 됩니다. Procoagulant 및 proinflammatory 자극 WPB exocytosis, VWF 출시에 급속 하 게 유도할 수 있다. 대부분 내 피 세포에 의해 풀어 놓인 VWF의 플라즈마;에서 순환 그러나, VWF의 비율 내 피 세포 표면에 고정은 됩니다. 생리 전단의 조건 하에서 내 피 고정 VWF 혈전 형성의 nidus 나타내는 VWF 혈소판 문자열을 형성, 혈소판에 바인딩할 수 있습니다. 시각적으로 재현 하 고 중재 하는 VWF 혈전 형성의 이상에 관련 된 방식으로 캡처 후속 혈소판 및 내 피 세포에서 VWF의 릴리스를 관찰 하는 흐름 챔버 시스템을 사용할 수 있습니다. 이 방법론을 사용 하 여, 내 피 세포는 교양 흐름 챔버에 고 이후에 WPB exocytosis 유도 하 secretagogues와 자극. 씻어 혈소판은 다음 활성화 endothelium에 끼얹는다. 혈소판 활성화 되 고 이후에 유체 흐름의 방향으로 길쭉한 VWF 문자열에 바인딩합니다. Procoagulant 및 proinflammatory 자극으로 extracellular 히스톤을 사용 하 여, 히스톤 치료 내 피 세포 치료 내 피 세포에 비해 증가 VWF 혈소판 문자열 형성을 관찰 합니다. 이 프로토콜 모델의 혈전 증 및 hemostasis 상호 작용 VWF 혈소판의 활성화의 양적, 시각, 그리고 실시간 평가 설명합니다.
Introduction
혈전 증 사망률 전세계1 의 주요 원인이 되 고 응답 todysregulated 혈소판 활성화 및 트 롬 빈 세대에 모두 veinsand 동맥에서 개발할 수 있습니다. VWF의 플라스마 수준 혈액 응고의 키 레 귤 레이 터, 그것에 의하여 낮은 수준 (< 50%)로 알려진 폰 Willebrand 질병 (VWD)2 그리고 상부 출혈 장애 발생 (> 150%) 정 맥3 의 위험 증가와 관련 된 고 4 동맥 혈전 증입니다.
VWF는 없으며 및 내 피 세포에 의해 합성 및 혈소판 α과 립 및 WPBs에 각각 저장 multimeric 당단백질 이다. Hemostatic 도전 시 VWF 순환 혈소판 활성화 된 내 피 세포5 또는6의 배 벽 노출 된 콜라겐을 밧줄로 내 피 WPBs에서 발표 될 수 있습니다. 내 피 세포에 VWF의 앵커 P selectin7 그리고 integrin αvβ38에 의해 중재에 표시 되었습니다. 혈소판 알파과 립 점포의 후속 릴리스 더욱 혈소판 혈소판 혈소판 플러그 형성, 응고 캐스케이드 및 섬유 소의 전파에 필요한 비 계에 대 한 상호 작용을 안정 된 VWF 농도 높일 수 있습니다. 증 착입니다. VWF의 혈소판 바인딩 활동 큰 hemostatic 활동9,10를 가진 높은 분자 무게 multimers와 그것의 multimeric 구조에 의해 통제 된다. 혈액 순환, VWF 또한 행위로 VIII 응고 인자에 대 한 캐리어.
유체 전단 응력 VWF 생리학의 필수 레 귤 레이 터 이다. 전단 응력의 부재, VWF 혈소판 당단백질 Ib 접착11에 대 한 바인딩 도메인 은폐 구형 형태로 존재 합니다. 전단 응력은 존재, metalloprotease, disintegrin 및 thrombospondin 모티브 (ADAMTS13), metalloprotease에 대 한 분열 사이트 노출 됩니다. ADAMTS13의 hemostatic 활동12줄일 적나라 하 고 혈소판 장식 VWF 문자열 multimer 크기 조절을 앞.
VWF 이라면 급성 상 단백질, 그리고 수많은 자극, hypoxia13, 감염14및 proinflammatory cytokines를 포함 하 여 내 피 세포에서 VWF 릴리스를 중재에 표시 되었습니다. 다른 비슷한 염증 성 에이전트, extracellular 히스톤 또한 표시 되었습니다 조직의 VWF 릴리스 마우스15,16 와 혈소판 생체 외에서17,18, 의 활성화를 유도 하 19.이 리에 차이점으로 히스톤 하위에 종속 되도록 표시 했다 및 아르기닌 콘텐츠 기능15에 영향을 미칠 수 있습니다. 우리의 연구 목표로 설정 흐름 챔버 리-리치 (홍콩)의 영향을 조사 하 모델과 아르기닌이 풍부한 (HR) 히스톤 하위 및 내 피 VWF 릴리스 및 실시간 혈소판에 secretagogues에 잠재적인 초기 이벤트 캡처 염증 유발 혈전 증
이 흐름 챔버 방법론 생체 외에서 시스템에 시각, 재현성, 고 정량에 vivo에서 상호 subendothelial 콜라겐, 내 피 세포, VWF, 및 혈소판이. VWF 혈소판 상호 작용, WPB 분 비, 혈소판 활성화, VWF 베이스 등을 조절 하는 통로의 모든 측면의 실시간 평가 대 한 수 있습니다. 제어 전단 응력 조건 하에서 VWF의 연구 VWF 릴리스 및 혈소판 바인딩 함수20, WPB 생리학21, VWF 분열 손상 VWD 돌연변이 평가 하 ADAMTS135에 의해 사용 되었습니다. 계량 한 염증 성 자극의 결과로 VWF 혈소판 문자열 형성이이 방법론 사용: extracellular 히스톤.
Protocol
Representative Results
Discussion
VWF 혈소판의 생리 적인 관련성 VWF 고착 효소 ADAMTS13의 그들의 급속 한 해체로 인해 논란이 남아 문자열, 그들은 사이트에서 VWF에 의해 혈소판 모집의 정량 생체 외에서 모델 역 히스톤 레벨5에 증가 지역화는 혈전의 존재 양식을 수 있습니다. 또한, 병 리 thrombotic thrombocytopenic 혈관 (TTP)으로-또는 염증 성 microenvironments-ADAMTS13 활동 같은 부족에 ADAMTS13 활동 저해 VWF 혈소판 문자…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
앨리슨 Michels 프레더릭 밴팅과 찰스 베스트 캐나다 대학원 장학금에서는 캐나다 연구소의 건강 연구 (CIHR)의 받는 사람입니다. 로 라 L. Swystun 받는 사람 CIHR 화목입니다. 데이비드 Lillicrap 캐나다 연구의 자에 분자 Hemostasis의 받는 사람입니다. 이 연구는 일부 CIHR 그랜트 (MOP-97849)를 운영 하 여 투자 되었다.
Materials
| Calf-thymus unfractionated histones (UH) | Worthington Biochemical | HLY | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus lysine-rich histones (HK) | Sigma-Aldrich | H5505 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Calf-thymus arginine-rich histones (HR) | Sigma-Aldrich | H4830 | Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL) |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | Reconstituted in DMSO (20 mM) |
| Histamine | Sigma-Aldrich | H7125-1G | Reconstituted in water (50 mg/mL) |
| 3,3' Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6) | Invitrogen | D273 | Reconstituted in methanol (20 mM) |
| Rabbit Anti-VWF Coating Antibody | DAKO | A0082 | For VWF ELISA |
| Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated | DAKO | P0026 | For VWF ELISA and histone-VWF binding assay |
| Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates | eBioscience | 44-2404-21 | For histone-VWF binding assay |
| Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates | Thermo Scientific | 3855 | For VWF ELISA |
| Humate-P | CSL Behring | N/A | Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex |
| Normal Reference Plasma | Precision BioLogic | CCNRP-05 | For VWF ELISA standard curve |
| O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent | Sigma-Aldrich | P8287 | Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006) |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | For culturing and initial seeding of BOEC |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | ThermoFisher Scientific | 14025092 | |
| Rat-tail Collagen Type 1 | Corning | 354236 | |
| Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media | ThermoFisher Scientific | 31985070 | For endothelial cell stimulations |
| METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software | Molecular Devices | N/A | |
| BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive | BD Biosciences | 366703 | |
| µ-Slide III 0.1 (flow chambers) | Ibidi | This product has been discontinued. We suggest using µ-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2 | |
| Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized | Ibidi | 10842 | |
| Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10825 | |
| Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized | Ibidi | 10802 | |
| Blunted 18G Needle | BD Biosciences | 305180 | |
| 20 mL syringes | BD Biosciences | 302830 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM | N/A | |
| Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope | Quorum Technologies | N/A | |
| Image Processing Software | ImageJ | N/A |
References
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