מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם
Summary
ג 'ל מסורתי ג' ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר.
Abstract
ג'ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה הנפוצה ביותר להפרדת שברי דנ"א; ולכן היא מיושמת באופן נרחב על תחום הביולוגיה ואחרים. עם זאת, פרוטוקול SGE המסורתי הוא די מייגע, ואת הניסוי לוקח זמן רב. יתר על כן, צריכת כימי בניסויים SGE הוא גבוה מאוד. עבודה זו מציעה שיטה פשוטה ההפרדה של שברי דנ"א מבוסס על שבב SGE. השבב נעשה על ידי מכונת חריטה. שני סדינים מפלסטיק משמשים את אור גירוי ואת פליטה של האות האופטי. אות הקרינה של להקות ה- DNA נאסף על ידי הטלפון החכם. כדי לאמת את השיטה, מופרדים 50, 100, ו- 1,000 bp DNA סולמות. התוצאות מראות כי סולם DNA קטן מ -5,000 BP ניתן לפתור תוך 12 דקות ועם רזולוציה גבוהה בעת שימוש בשיטה זו, המציין כי היא תחליף אידיאלי לשיטה המסורתית SGE.
Introduction
סלע ג'ל אלקטרופורזה (SGE) היא השיטה היעילה ביותר עבור הפרדת קטע DNA 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ולכן הוא נחשב כלי רב תכליתי ב ביוכימי וביולוגי מנתח 6 , 7 , 8 . עם זאת, ניסויים רבים מצביעים כי SGE מוגבל על ידי ארבע הבעיות הבאות: (1) ההפרדות לוקח שעות רבות, ואפילו ימים; (2) הצריכה הכימית גבוהה מאוד; (3) זה דורש מנגנון מסובך ( למשל, תא אלקטרופורזה 2D, ספק כוח אלקטרופורזה, מערכת ג 'ל הדמיה); (4) מערכת הדמיה ג'ל יכול רק לראות את שברי ה- DNA מופרדים כאשר הניסוי הוא סיים. יתר על כן, ethidium bromide (EtBr), אשר נפוץ ב SGE 9 ,התחת = "xref"> 10, הוא mutagenic ו סרטן 11 , 12 . לכן, כפפות תמיד צריך להיות משוחק כאשר מסירת ג'לים המכילים EtBr.
נימי אלקטרופורזה (CE) יש יתרונות רבים 13 , 14 , 15 , 16 , 17 לעומת SGE, כגון פעולה אוטומטית, זמן ההפרדה קצר, וצריכה נמוכה יותר. עם זאת, מכשיר CE הוא די יקר. לכן, כדי להתגבר על המגבלות הללו, פותחה מערכת ( איור 1 ) להפרדת הדנ"א. מערכת כזו יכולה לא רק לצמצם באופן משמעותי את הצריכה הכימית ולשמור על זמן הניסוי SGE (<8 דקות), אבל זה יכול גם לבצע מעקב בזמן אמת של תהליך ההפרדה DNA ב agarose ג'ל על ידי הטלפון החכם. על ידי ביצוע ההליכים המתוארים בפרוטוקול זה, סטודנטים shouיהיה מסוגל לעצב לפברק את שבב SGE, להכין את הג'ל agarose שבב, להקים מערכת פשוטה SGE עם הטלפון החכם, ולתעד את תהליך הגירה דנ"א של agarose ג'ל.
Protocol
Representative Results
Discussion
Agarose ג'ל אלקטרופורזה מועסק נרחב עבור הפרדת DNA, RNA, וחלבון. עבודה זו מציעה שיטה חדשה להחליף את פרוטוקול אלקטרופורזה ג'ל המסורתית. תוצאות מדגימות כי 50, 100, ו 1000 bp סולמות DNA ניתן להפריד היטב כזה מכשיר קטן התאספו. היתרון הגדול של שיטה זו הוא כי לא רק זה יכול להפריד בין חומצו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים בהכרת תודה לתמיכה של הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מס '21205078) וקרן המחקר לתכנית הדוקטורט להשכלה גבוהה של סין (No.20123120110002). עבודה זו נתמכה חלקית על ידי התוכנית הלאומית למחקר ופיתוח של סין (2016YFB1102303), התוכנית הלאומית למחקר בסיסי של סין (973Program, 2015CB352001), והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (61378060).
Materials
| 10×TBE | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd. | T1051 |
| 50bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3421A |
| 100bp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3422A |
| 1kbp DNA ladder | Takara Bio Inc. | 3426A |
| SYBR GREEN | Takara Bio Inc. | 5760A |
| Agarose | Sigma-Aldrich Corporate | V900510 |
References
- Carle, G. F., Olson, M. V. Separation of chromosomal DNA molecules from yeast by orthogonal-field-alternation gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 12 (14), 5647-5664 (1984).
- McDonell, M. W., Simon, M. N., Studier, F. W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol. 110 (1), 119-146 (1977).
- Fangman, W. L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucleic. Acids. Res. 5 (3), 653-665 (1978).
- Blum, H., Beier, H., Gross, H. J. Improved silver staining of plant proteins, RNA and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis. 8 (2), 93-99 (1987).
- Gödde, R., et al. Electrophoresis of DNA in human genetic diagnostics-state-of-the-art, alternatives and future prospects. Electrophoresis. 27 (5-6), 939-946 (2006).
- Studier, F. W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol. 79 (2), 237-248 (1973).
- Sugden, B., De Troy, B., Roberts, R. J., Sambrook, J. Agarose slab-gel electrophoresis equipment. Anal. Biochem. 68 (1), 36-46 (1975).
- Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. J. Proteomics. 73 (11), 2064-2077 (2010).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923 (2012).
- Gasser, R. B., et al. Single-strand conformation polymorphism (SSCP) for the analysis of genetic variation. Nat. Protoc. 1 (6), 3121-3128 (2006).
- Matselyukh, B. P., Yarmoluk, S. M., Matselyukh, A. B., Kovalska, V. B., Kocheshev, I. O., Kryvorotenko, D. V., Lukashov, S. S. Interaction of cyanine dyes with nucleic acids: XXXI. Using of polymethine cyanine dyes for the visualization of DNA in agarose gels. J. Biochem. Biophys. Methods. 57 (1), 35-43 (2003).
- Lunn, G., Sansone, E. B. Ethidium bromide: destruction and decontamination of solutions. Anal. Biochem. 162 (2), 453-458 (1987).
- Li, Z., Liu, C., Zhang, D., Luo, S., Yamaguchi, Y. Capillary electrophoresis of RNA in hydroxyethylcellulose polymer with various molecular weights. J. Chormatogr. B. 1011, 114-120 (2016).
- Li, Z., Liu, C., Ma, S., Zhang, D., Yamaguchi, Y. Analysis of the inhibition of nucleic acid dyes on polymerase chain reaction by capillary electrophoresis. Anal. Methods-UK. 8 (11), 2330-2334 (2016).
- Liu, F., et al. Developing a fluorescence-coupled capillary electrophoresis based method to probe interactions between QDs and colorectal cancer targeting peptides. Electrophoresis. 37 (15-16), 2170-2174 (2016).
- Wang, J., et al. A capillary electrophoresis method to explore the self-assembly of a novel polypeptide ligand with quantum dots. Electrophoresis. 37 (15-16), 2156-2162 (2016).
- Miao, P., et al. Nuclease assisted target recycling and spherical nucleic acids gold nanoparticles recruitment for ultrasensitive detection of microRNA. Electrochim. Acta. 190, 396-401 (2016).
- Heller, C. Principles of DNA separation with capillary electrophoresis. Electrophoresis. 22 (4), 629-643 (2001).
