Peptídeos e proteínas quantificação usando Automated imuno-MALDI (iMALDI)
Summary
Um protocolo para a quantificação de proteínas em fluidos biológicos complexos usando tecnologia automatizada imuno-MALDI (iMALDI) é apresentado.
Abstract
Espectrometria de massa (MS) é uma das tecnologias mais utilizadas para quantificar proteínas em amostras complexas, com especificidade de excelente ensaio em resultado da detecção direta de relação massa-de-carga de cada molécula do alvo. No entanto, proteômica baseada em MS, como a maioria das outras técnicas analíticas, tem um viés para medição alta abundância analitos, então é um desafio para atingir limites de deteção de baixo ng/mL ou pg/mL em amostras complexas e isto é o intervalo de concentração para muitos doença-relevantes proteínas em biofluids tais como plasma humano. Para auxiliar na detecção de baixa abundância analitos, imuno-enriquecimento foi integrado no ensaio para concentrar-se e purificar o analito antes da medição do MS, melhorando significativamente a sensibilidade do ensaio. Neste trabalho, a imuno – Matrix-Assisted Laser dessorção/ionização (iMALDI) tecnologia é apresentada para a quantificação de proteínas e peptídeos em biofluids, com base em imuno-enriquecimento em grânulos, seguida por MALDI-MS medição sem prévia eluição. Os anticorpos antipeptídeos são acrescidos em grânulos magnéticos e incubados com amostras. Após a lavagem, os grânulos são transferidos diretamente em uma placa de destino MALDI, e os sinais são medidos por um MALDI-tempo de instrumento de voo (MALDI-TOF) após a solução de matriz foi aplicada aos talões. O procedimento de preparação de amostra é simplificado em comparação com outros ensaios imuno-MS, e a medição de MALDI é rápida. A preparação de toda a amostra é automatizada com um manuseio sistema, com reprodutibilidade do ensaio melhorada e uma taxa de transferência de líquidos. Neste artigo, o ensaio de iMALDI é usado para determinar a angiotensina peptídeo eu (Ang eu) concentração no plasma, que é usado clinicamente como leitura da atividade de renina do plasma para o rastreio de aldosteronismo primário (PA).
Introduction
Espectrometria de massa tornou-se uma ferramenta indispensável em proteômica quantitativa. Espectrometria de massa pode determinar as massas de alvo proteínas ou peptídeos, portanto, os sinais obtidos do analito podem ser altamente específicos em comparação com os imunoensaios. Dois métodos de ionização, electrospray e MALDI, são mais comumente utilizados para a detecção de proteínas e peptídeos1,2,3,4. Um grande desafio na quantificação da proteína baseada em MS situa-se na detecção de proteínas de baixo-abundância em amostras complexas, em concentrações ng/mL ou pg/mL, na presença de proteínas de alta-abundância, e muitos biomarcadores de candidato proteína encontradas no plasma humano são dentro desta escala5. Esse problema é causado pela maior parte pelo inerentemente ampla faixa dinâmica e complexidade do proteoma humano6.
Para superar esses desafios de deteção, foram desenvolvidos métodos imuno-MS para enriquecer o alvo proteínas ou peptídeos partir das soluções de amostra em uma superfície sólida, seguido por eluição dos analitos e MS medição7,8 , 9 , 10. através de imuno-enriquecimento, os analitos são purificados de amostras complexas e, por conseguinte, os efeitos do íon-supressão de outras moléculas são minimizados. Entre vários suportes sólidos, grânulos magnéticos são atualmente mais amplamente utilizados como eles têm as vantagens da capacidade de ligação do anticorpo alta e facilidade de manuseio. Esferas magnéticas com functionalizations diferentes e tamanhos foram desenvolvidas e comercializadas para experimentos de imunoprecipitação. Até à data, imuno-enriquecimento em grânulos tem sido interfaceado com ionização electrospray (ESI) e MALDI-MS para medição de proteínas e peptídeos. Em padrões de isótopo estável e captura pela tecnologia de anticorpos antipeptídeo (SISCAPA), proteínas nas amostras são digeridas, seguido de incubação com grânulos de anticorpo-revestido para imuno-enriquecimento. No SISCAPA “clássica”, os peptídeos proteotypic capturados são eluídos dos grânulos e medidos pelo líquido cromatografia-ESI-MS (LC-MS), ou por infusão direta ESI-múltiplas reação monitoramento-MS (ESI-MRM-MS)11,12. Imuno-enriquecimento melhorou a sensibilidade do ensaio MRM, por 3-4 ordens de magnitude, atingindo os de gama baixa ng/mL13.
Em comparação com electrospray-MS, MALDI-MS é mais rápido e não envolve a limpeza e a re-equilibração de colunas LC então não há problemas reportes e contaminação, tornando-o mais adequado para estudos de alta produtividade14. Imuno-MALDI tecnologia foi desenvolvida em nosso laboratório para combinar imuno-enriquecimento com MALDI-MS para quantificação de sensível e específica de peptídeos e proteínas (com base na quantificação de peptídeos proteotypic)15,16 ,17. Depois imuno-enriquecimento, os grânulos são depositados sobre uma placa MALDI-alvo, a solução de matriz é adicionado à grânulos e o prato está pronto para análise por um MALDI-TOF-MS após a secagem. Eluição dos peptides da missanga não é executada como uma etapa separada, mas ligados a afinidade analitos são eluídos por solução de matriz a MALDI quando ele é adicionado aos pontos do grânulo, desse modo simplificando a preparação da amostra e minimizando a perda de amostra. A tecnologia de iMALDI tem sido aplicada em uma variedade de aplicações de18,19e recentemente foi automatizada e utilizada para a medição da angiotensina eu (Ang eu) para a determinação de plasma renina atividade (PRA)20. Este protocolo irá demonstrar o procedimento utilizado para realizar um ensaio iMALDI automatizado. O ensaio PRA a tomar como exemplo, inter dias CVs de menos de 10% foram obtidos por meio da automação, com a capacidade de medir 744 amostras por dia20.
O ensaio PRA iMALDI demonstrado neste manuscrito não requer digestão de proteínas, como a molécula alvo (Ang eu) é um peptídeo com um peso molecular de 1295.7 Da. Em outros ensaios, onde a digestão de proteínas é necessário e um peptídeo é usado como o substituto para a proteína intacta, o peptídeo selecionado para iMALDI deve ser exclusivo e específico para a proteína do alvo, com uma massa mais de 800 Da então que ele pode ser distinguido facilmente o c hemical ruído a partir da solução de matriz MALDI. Anticorpos antipeptídeos são necessários para o imuno-enriquecimento dos peptides. O protocolo para um ensaio de iMALDI medição PRA consiste em quatro etapas: 1) geração de Ang I em plasma humano; 2) imuno-enriquecimento de Ang I usando grânulos anticorpo-revestido; 3) transferência de contas para uma placa-alvo MALDI e adicionando solução de matriz; e 4) aquisição de sinal por uma análise de dados e MALDI-TOF-MS20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Comparado a quantificação de proteína convencional baseada em MS, iMALDI utiliza anticorpos para enriquecer os analitos e purificá-los de amostras complexas, portanto, tornando possível quantificar proteínas ou peptídeos em baixas concentrações. Um passo crítico no protocolo iMALDI é o imuno-enriquecimento dos peptides alvo. Para este efeito, devem ser selecionados anticorpos com alta especificidade e afinidade. Em SISCAPA, relatou-se que seriam necessários para atingir alta sensibilidade em baixa ng/mL<sup c…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos o apoio financeiro de Canadá do genoma e genoma da Colúmbia Britânica para operações (204PRO) e desenvolvimento de tecnologia (214PRO) através de rede de inovações o genoma (gim). Agradecemos a plataforma de descoberta de drogas do Instituto de pesquisa do centro de saúde de Universidade McGill para a utilização do instrumento MALDI-TOF para as filmagens. H.L. é grato pelo apoio de uma bolsa de pós-doutorado do nacional de ciência e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). C.H.B é grato pelo apoio de fundo de dotação a Leading Edge (Lopes). C.H.B. é grato pelo apoio da cadeira McGill Segal em Oncologia Molecular da McGill University (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. e C.H.B. estão gratos pelo apoio de Warren Y. Soper Charitable Trust e o Alvin Segal Family Foundation para o Hospital Geral judaico (Montreal, Quebec, Canadá).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
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