Péptido y proteína cuantificación usando automatizado inmuno-MALDI (iMALDI)
Summary
Se presenta un protocolo para la cuantificación de proteínas en fluidos biológicos complejos utilizando tecnología automatizada inmuno-MALDI (iMALDI).
Abstract
Espectrometría de masas (MS) es una de las tecnologías más utilizadas para la cuantificación de proteínas en muestras complejas, con la especificidad del ensayo excelente como resultado de la detección directa de la relación masa / carga de cada molécula de la blanco. Sin embargo, proteómica basada en la MS, como la mayoría otras técnicas analíticas, tiene un sesgo hacia la medición de analitos de alta abundancia, por lo que es un reto a alcanzar límites de detección bajos ng/ml o pg/mL en muestras complejas y esto es el intervalo de concentraciones para muchos proteínas enfermedad relevante en biofluidos como plasma humano. Para ayudar en la detección de analitos de baja abundancia, inmuno-enriquecimiento ha sido integrado en el ensayo para concentrar y purificar la sustancia a analisar antes de medición MS, mejorando significativamente la sensibilidad del ensayo. En este trabajo, la tecnología de inmuno – mediante desorción/ionización del Laser (iMALDI) es presentada para la cuantificación de proteínas y péptidos en biofluidos, basada en inmuno-enriquecimiento en granos, seguida por MALDI-MS medida sin previa elución. Los anticuerpos anti péptidos son funcionalizados en bolas magnéticas y se incubaron con muestras. Después del lavado, los granos son transferidos directamente en un plato blanco MALDI y las señales son medidas por un MALDI-tiempo de instrumento de vuelo (MALDI-TOF) después de la solución de la matriz se ha aplicado a los granos. Se simplifica el procedimiento de preparación de la muestra en comparación con otros ensayos inmuno-MS, y la medición de MALDI es rápida. La preparación de toda la muestra se automatiza con un líquido, manejo del sistema, con mayor rendimiento y mejor reproducibilidad. En este artículo, el ensayo de iMALDI se utiliza para determinar la angiotensina péptido I (Ang I) concentración en el plasma, que se utiliza clínicamente como lectura de la actividad de renina plasmática para la detección del aldosteronism primario (PA).
Introduction
Espectrometría de masas se ha convertido en una herramienta indispensable en proteómica cuantitativa. Espectrometría de masas puede determinar las masas de blanco proteínas o péptidos, por lo tanto las señales del analito obtenido pueden ser altamente específicas en comparación con los inmunoensayos. Dos métodos de ionización por electrospray y MALDI, comúnmente se utilizan para la detección de proteínas y péptidos1,2,3,4. Un desafío importante en la cuantificación de la proteína basada en MS radica en la detección de proteínas de baja abundancia en muestras complejas en las concentraciones de ng/mL o pg/mL en presencia de proteínas de alta abundancia, y muchos candidatos biomarcadores de proteínas encontradas plasma humano son dentro de esta gama5. Este problema es causado en gran parte por el inherentemente amplio rango dinámico y la complejidad del proteoma humano6.
Para superar estos desafíos de detección, se han desarrollado métodos inmuno-MS para enriquecer el objetivo proteínas o péptidos de las soluciones de la muestra sobre una superficie sólida, seguido por elución de los analitos y MS medida7,8 , 9 , 10. a través del enriquecimiento de inmuno, se purifican los analitos de muestras complejas y por lo tanto se reducen al mínimo los efectos del ion-supresión de otras moléculas. Entre diferentes soportes sólidos, bolas magnéticas son actualmente más utilizados ya que tienen las ventajas de la capacidad de unión de anticuerpos alto y facilidad de manejo. Granos magnéticos con diferentes functionalizations y tamaños se han desarrollado y comercializado para los experimentos de inmunoprecipitación. Hasta la fecha, inmuno-enriquecimiento en granos ha sido interconectado con ionización por electrospray (ESI) y MALDI-MS para la medición de proteínas y péptidos. En normas de isótopos estables y captura por la tecnología de los anticuerpos anti péptido (SISCAPA), son digeridas proteínas en las muestras, seguido por la incubación con los granos recubiertos de anticuerpos inmuno-enriquecimiento. En SISCAPA “clásico”, los péptidos de proteotypic capturados son eluidos de los granos y mide por líquido cromatografía-ESI-MS (LC-MS), o por infusión directa ESI-múltiple reacción monitoreo-MS (MRM-ESI-MS)11,12. Inmuno-enriquecimiento mejoró la sensibilidad del ensayo MRM en 3-4 órdenes de magnitud, alcanzando los bajos ng/mL rango13.
En comparación con electrospray-MS, MALDI-MS es más rápido y no involucra la limpieza y volver a equilibrar columnas LC por lo que no existen problemas contaminación cruzada y la contaminación, lo que es más adecuado para estudios de alto rendimiento14. Inmuno-MALDI tecnología ha sido desarrollada en nuestro laboratorio para combinar inmuno-enriquecimiento con MALDI-MS para la cuantificación sensible y específica de péptidos y proteínas (basadas en la cuantificación de péptidos proteotypic)15,16 ,17. Después de inmuno-enriquecimiento, los granos se depositan en una placa de destino de MALDI, la solución de la matriz se agrega a los granos y la placa está lista para el análisis por MALDI-TOF-MS después del secado. Elución de los péptidos de los granos no se realiza como un paso separado, pero afinidad-limite los analitos se eluyen por la solución de matriz MALDI cuando se añade a los puntos de grano, lo que simplifica la preparación de la muestra y minimizar la pérdida de muestra. La tecnología iMALDI se ha aplicado en una variedad de aplicaciones18,19y recientemente ha sido automatizada y utilizado para medir la angiotensina I (Ang I) para la determinación de la actividad (PRA) de renina de plasma20. Este Protocolo será demostrar el procedimiento utilizado para realizar un análisis automatizado iMALDI. Tomando el ensayo PRA como ejemplo, CV interdía de menos del 10% se han logrado gracias a la automatización, con la capacidad de medición de las 744 muestras por día20.
El ensayo PRA iMALDI demostrado en este manuscrito no requiere digestión de proteínas, como la molécula objetivo (Ang I) es un péptido con un peso molecular de 1295.7 Da. En otros ensayos donde hay digestión de proteína y un péptido es utilizado como el sustituto de la proteína intacta, el péptido seleccionado para iMALDI debe ser único y específico a la proteína diana, con una masa más de 800 Da para que ello puede distinguirse fácilmente de la c hemical ruido de la solución de matriz MALDI. Anticuerpos anti péptidos son necesarios para el inmuno-enriquecimiento de los péptidos. El protocolo de un ensayo de iMALDI medición PRA consta de cuatro pasos: 1) generación de Ang I en plasma humano; 2) inmuno-enriquecimiento de Ang I utilizando granos recubiertos de anticuerpos; 3) transferencia de granos a una placa de destino de MALDI y agregar solución de matriz; y 4) adquisición de la señal por un MALDI-TOF-MS y los datos de análisis20.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con la cuantificación de proteína convencional basada en MS, iMALDI utiliza anticuerpos para enriquecer los analitos y purificarlos de muestras complejas, por lo tanto, lo que permite cuantificar proteínas o péptidos en bajas concentraciones. Un paso crítico en el protocolo de iMALDI es inmuno-enriquecimiento de los péptidos de destino. Para ello, se deben seleccionar anticuerpos con alta especificidad y afinidad. En SISCAPA, se ha divulgado que las afinidades de anticuerpo en el 10-9 M o…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos el apoyo financiero del genoma Canadá y Columbia Británica de genoma para operaciones (204PRO) y desarrollo de la tecnología (214PRO) a través de la red genoma de innovaciones (Ginebra). Agradecemos a la plataforma de descubrimiento de droga en el Instituto de investigación del centro de salud de la Universidad McGill para el uso del instrumento MALDI-TOF para la filmación. H.L. está agradecido por apoyo de una beca postdoctoral de la National Science and Engineering Research Consejo de Canadá (NSERC). C.H.B está agradecida por el apoyo del fondo de dotación de vanguardia (LEEF). C.H.B. está agradecido por apoyo de la Presidencia de McGill Segal en Oncología Molecular en la Universidad McGill (Montreal, Quebec, Canadá). M.X.C. y C.H.B. son agradecidos por apoyo de Warren Y. Soper Charitable Trust y la Fundación de familia de Segal de Alvin en el Hospital General judío (Montreal, Quebec, Canadá).
Materials
| Healthy control human plasma | Bioreclamation | HMPLEDTA2 | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830 | |
| Ammonium citrate dibasic | Sigma Aldrich | 09833 | |
| CHAPS (>=98%) | Sigma Aldrich | C9426 | |
| Albumin from chicken egg white (>98%) | Sigma Aldrich | A5503 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma Aldrich | EDS | |
| Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid | Sigma Aldrich | 70990 | |
| Phosphate buffered saline | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride | Sigma Aldrich | 78830 | |
| Trifluoroacetic acid | Thermo Fisher Scientific | 85172 | LC-MS grade |
| acetonitrile | Fluka | 34967 | LC-MS grade |
| water | Fluka | 39253 | LC-MS grade |
| acetic acid | Fluka | 320099 | LC-MS grade |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Roche Diagnostics | 3118169001 | |
| Dynabeads Protein G magnetic beads | Thermo Fisher Scientific | 10003D | 2.8 μm, 30 mg/mL |
| anti-Ang I goat polyclonal antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-7419 | |
| Nat and SIS Ang I | synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre | ||
| Automated liquid handling system | Agilent | 16050-102 | Agilent Bravo robotic workstation |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12321D | Invitrogen DynaMag-2 magnet |
| Tube rotator | Theromo Scientific | 400110Q | Labquake Tube Rotator |
| Magnet | Thermo Fisher Scientific | 12027 | DynaMag-96 side skirted magnet |
| Magnet | VP Scientific | 771RM-1 | used to pull the beads to the bottom of the well |
| MALDI-TOF | Bruker | Bruker Microflex LRF instrument |
References
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Nicol, G. R., et al. Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients. Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).
- Webster, J., Oxley, D., Zanders, E. D. . Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols. , 227-240 (2012).
- Yergey, A. L., et al. De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).
- Anderson, L. Six decades searching for meaning in the proteome. J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).
- Landegren, U., et al. Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis. Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).
- Guo, A., et al. Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation. Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).
- Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate. Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).
- Fredolini, C., et al. Immunocapture strategies in translational proteomics. Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).
- Tran, J. C., et al. Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies. Anal. Chem. , (2016).
- Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow. N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).
- Razavi, M., et al. High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry. J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).
- Anderson, N. L., et al. SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device. Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).
- Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. Mass-spectrometry-based clinical proteomics – a review and prospective. The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).
- Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).
- Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II. Methods. 56 (2), 213-222 (2012).
- Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension. Clin. Proteomics. 10 (1), 20 (2013).
- Jiang, J., et al. Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis. Proteomics Clin Appl. 1, (2007).
- Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis. Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).
- Popp, R. An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI). Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).
- Schoenherr, R. M., et al. Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry. J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , (2010).
- Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , (2011).
- Weiß, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).
- Nelson, A. L. Antibody fragments: Hope and hype. mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).
- Gupta, V., et al. An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein. Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).
