Summary
Her, ble kraften av en transposon-mediert tilfeldige innsetting av en ikke-koding DNA-element brukt til å løse optimale chromosomal plasseringen.
Abstract
Den optimale chromosomal stillingen(e) over et gitt DNA element var/ble fastsatt av transposon-mediert tilfeldige innsetting etterfulgt av fitness utvalg. I bakterier, kan virkningen av genetisk sammenheng på funksjon av en genetisk element være vanskelig å vurdere. Flere mekanismer, inkludert topologisk, transcriptional forstyrrelser fra nærliggende gener, og/eller replication-assosiert genet dosering, kan påvirke funksjonen til et gitt genetisk element. Her beskriver vi en metode som tillater tilfeldig integrering av en DNA-element i kromosomet Escherichia coli og velg de mest gunstige lokasjonene ved hjelp av en enkel vekst konkurranse eksperimentere. Metoden utnytter en godt beskrevet transposon-basert system for tilfeldige innsetting, kombinert med et utvalg av de fittest clone(s) av vekst fordel, en prosedyre som lett justerbar eksperimentelle behov. Naturen av de fittest clone(s) kan bestemmes av hele-genome sekvensering på komplekse multi klonal innbyggere eller enkel genet gå i rask identifikasjon av valgte kloner. Her, ble ikke-koding DNA regionen DARS2, som kontrollerer initiering av kromosom replikasjon i E. coli, brukt som et eksempel. Funksjonen for DARS2 er kjent for replikering-assosiert genet dosering; den nærmere DARS2 får opprinnelsen til utryddelse, jo mer aktiv blir. DARS2 var tilfeldig inn kromosomet av en DARS2-slettet belastning. De resulterende Klonene som inneholder personlige innsettinger var samlet og konkurrerte mot hverandre i hundrevis av generasjoner. Endelig var fittest kloner preget og inneholdt DARS2 i nærheten av den opprinnelige DARS2 plasseringen.
Introduction
Funksjonen av genetiske elementer kan påvirkes av beliggenheten i genomet. I bakterier skyldes dette hovedsakelig forstyrrelser av transkripsjon av nærliggende gener, lokale DNA topologien eller replication-assosiert genet dosering. Spesielt prosessene av utryddelse og segregering er kontrollert, minst i delen, av ikke-koding chromosomal regioner1og den riktige funksjonen av disse regionene avhenger på genomisk plassering/kontekst. I E.coli, eksempler er dif området, kreves for søster kromosom løsning2; KOPS sekvenser, kreves for kromosom segregering3; og datA, DARS1og DARS2 områder, nødvendig for riktig chromosomal replikering kontroll (nedenfor; 4). presenterer vi en metode som tillater for tilfeldig flytting, utvalg og bestemmelse av den optimale genetiske konteksten av enhver genetisk element, eksemplifisert her ved studiet av DARS2 ikke-koding regionen.
E. coli, DnaA er initiativtaker protein ansvarlig for DNA strand åpning på én replikering opprinnelseoriCog rekruttering av helicase DnaB5,6,7. DnaA tilhører AAA+ (dvs. ATPases forbundet med ulike aktiviteter) proteiner og kan binde både ATP og ADP med lignende høy slektskap5. Nivået av DnaAATP topper på innvielsen8, der DnaAATP danner en multimer på oriC som utløser DNA dobbeltsidig åpning9. Etter innvielsen, oriC er gjort utilgjengelig for ny innvielse på grunn av lagring av en mekanisme som involverer binding av SeqA protein til hemimethylated oriC10,11. Under lagring, nivået av DnaAATP er redusert med minst to mekanismer: den regulatoriske inaktivering av DnaA (RIDA)12,13 og datA-avhengige DnaAATP hydrolyse (DDAH)14 ,15. Både RIDA og DDAH fremme konvertering av DnaAATP til DnaAADP. Før en ny runde av innvielsen, DnaAADP aktiveres på nytt til DnaAATP på bestemte DnaA-reaktivere sekvenser (DARS): DARS1 og DARS216,17. Chromosomal datA, DARS1, ogDARS2 er ikke-koding og opptre på en Anstandsdame-lignende måte å modulere DnaAATP/DnaAADP interconversion. Disse regionene, utenfor opprinnelsen til replikering aktiverer montering av en DnaA kompleks for inaktivering (datA, 14) eller Aktivisering (DARS1 og DARS2, 17) av DnaA. Slette DARS2 i en celle, endrer ikke masse dobling tid men resultater i asynkron replikering innvielsen15,16,18. Men DARS2-mangelfull celler har en fitness kostnader i forhold til en ellers isogenic wildtype under både kontinuerlig vekst konkurranse i rike medium eller under etableringen av kolonisering i musen tarmen18. Dette betyr at selv små endringer i asynchrony/opprinnelse konsentrasjon har en negativ effekt på bakteriell fitness. I E. colier en selektiv press for å opprettholde kromosom symmetri (dvs. to nesten like lange replikering armer)19. Dataene, DARS1og DARS2 regioner har samme relative avstanden til oriC i alle E. coli stammer sekvensert18, til tross for store variasjoner i kromosom størrelse.
Her bruker vi DARS2 regionen av E. coli som et eksempel for identifikasjon av chromosomal stillingen(e) optimalt for sin funksjon. DARS2 ble satt inn i den NKBOR transposon, og den resulterende NKBOR::DARS2 transposon deretter inn tilfeldig genomet av MG1655 ΔDARS2. Vi dermed generert en samling celler, hver besittelse DARS2 plassert et annet sted på kromosomet. Et i vitro konkurranse eksperiment der alle cellene i samlingen var samlet og konkurrerte mot hverandre kontinuerlig vekst i LB i en estimert 700 generasjoner, ble utført. Utfallet av konkurransen eksperimentet ble overvåket/bestemt sørlige blot, enkel genet gå og hele-genome sekvensering (WGS; Figur 1). End-Point kloner løses ved enkel genet gå var preget av flowcytometri å vurdere celle syklus parametere. I et flow cytometric analyse, kan Cellestørrelse, DNA innhold og initiering synkronisering måles for et stort antall celler. Under flowcytometri, en strøm av enkeltceller passerer en lysstråle med riktige bølgelengden å opphisse farget DNA, som er deretter samtidig registrert av photomultipliers som samler den slippes ut fluorescensen, et mål på DNA innhold, forutsatt at celler er farget for DNA. Fremover-spredt lyset er et mål på cellen masse20.
I vitro konkurranse eksperimentet vi presenterer her brukes til å løse spørsmål knyttet til betydningen av chromosomal posisjon og genomisk sammenheng med genetisk elementet. Metoden er upartisk og brukervennlig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. innsamling av Transposon biblioteket
Merk: chromosomal DARS2 locus ble klonet i mini Tn 10-basert transposon, NKBOR (på pNKBOR) 21, noe som resulterer i NKBOR:: DARS2 (pJFM1). pNKBOR kan fås online 22. pNKBOR er en R6K-baserte selvmord vektor som krever initiatoren protein π for replikering 23. Plasmider pJFM1 er derfor i stand til å gjenskape i en E. coli belastning (f.eks Dh5α λ pir) som inneholder en chromosomal kopi av pir genet. Men når pJFM1 er forvandlet til Pir-mangelfull wildtype MG1655, pJFM1 ikke gjenskape, førte til valget av kanamycin-motstandsdyktig kloner generert av tilfeldige innsettinger av NKBOR:: DARS2 i bakteriell kromosomet. For enkelhet kalles dette DARS2 innsettinger. Se figur 1 for en skjematisk fremstilling av metodikken.
- Forberede electrocompetent MG1655 Δ DARS2 fra aktivt voksende celler i Lysogeny kjøttkraft (LB) dyrkes på 37 ° C 24.
- Electroporate pJFM1 i electrocompetent MG1655 Δ DARS2, ifølge Gonzales et al. 24
- legge 1 µg av pJFM1 (i 1 µL av vann) til 40 µL av electrocompetent E. coli MG1655 Δ DARS2 og overføre denne blandingen til pre kjølt, sterile 0,2-cm gapet søppel. Cuvette inn electroporation kammeret. Electroporate 18 kV, 500 Ω og 25 µF; tiden konstant bør være ~5.0 ms, og ingen lysbuedannelse bør skje.
- Raskt gjenopprette bakteriell suspensjon av resuspending det i 1 mL av forvarmes LB buljong og overføring til et 15 mL reagensrør.
- La cellene gjenopprette rugende under karbonisert vekst forhold ved 37 ° C i 30 min, uten antibiotikumet utvalg. Plate bakterier på LB agar plater med 50µg/mL kanamycin og Inkuber på 37 ° C over natten.
- Telle koloniene fra electroporation: en koloni anses lik en chromosomal transposon innsetting.
Merk: Kolonier kan telles av øye eller en koloni teller. Koloniene er omvendt proporsjonal med den gjennomsnittlige avstanden skille transposons i kromosomet av hver klon. - Legge til 1 mL av LB kjøttkraft til hver plate og vaske av alle koloniene; 1 mL av LB kjøttkraft bør være tilstrekkelig til å vaske av ~ 100.000 kolonier. Bruke den samme 1 mL av LB kjøttkraft å øke bakteriell konsentrasjonen. Samle alle koloniene i samme 50 mL tube.
- Vortex tube og fryse start materialet (t = 0). Hvis du vil fryse den, bland 1 mL av cellen suspensjon med 1 mL av 50% glyserol på is. Overføre rør til tørk is 10 min. Når kulturer er frosset, overføre dem til en-80 ° C fryser.
Merk: En celle konsentrasjon av minst 50.000 CFU/mL er ventet på dette trinnet.
2. Konkurranse eksperiment i LB
- tøvær transposon biblioteket fra-80 ° C på is. Blandingen av pipettering.
- Overføre 100 µL av transposon biblioteket til 10 mL av LB i et 15 mL reagensrør.
- Vokse cellene, karbonisert av kontinuerlig risting (250 rpm), for 8 h på 37 ° C til stasjonære fase (dvs. OD 600 = ~ 4.0). Justere disse parameterne ulike vekst forhold, som.
- Overføres bakteriell befolkningen av kontinuerlig transport i frisk prewarmed medium hver ~ 10 generasjoner. Gjør dette ved å overføre 10 µL av forrige stasjonære fase kultur til 10 mL av fersk LB og voksende en annen 8 h til stasjonære fase (dvs. OD 600 = ~ 4.0).
Merk: Som start- og optisk densitet er de samme, en 1000 ganger fortynning tilsvarer ~ 10 generasjoner av vekst (2 10 = 1024). Bakteriell befolkningen kan enten overført direkte til frisk prewarmed medium eller lagre 0-4 ° C (på is) og spredte dagen. LB ble brukt her for å sikre at så mange mobilnettet doublings i så kort tid som mulig (en dobling tid nær 22 min). - Etter hver 100 generasjoner konkurransen, lagre fem 1-mL eksempler på-80 ° C (som beskrevet i trinn 3.3).
- Hvis fitness forskjellene mellom cellene som inneholder individuelle transposon innsettinger forventes å være liten, holde konkurranse lenge; her, 700 generasjoner (t = 700) ble brukt.
3. Sørlige Blot analyse å overvåke konkurransen eksperiment Over tid
- forbereder sonden for den sørlige blott (1-kb-delen av NKBOR) ved å utføre polymerase kjedereaksjon (PCR) forsterkning med bestemte primere: NKBOR_Probe_FW : gatgttggacgagtcggaat og NKBOR_Probe_RV: cgttacatccctggcttgtt.
- Incubate på 98 ° C for 30 s første rødsprit. Deretter utfører 35 sykluser på 98 ° C for 10 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C for 45 s. For endelig utvidelse, bruke 72 ° C for 10 min.
Merk: Malen for PCR reaksjonen var renset pNKBOR plasmider 21. - Merke resulterende PCR fragmentet med [α - 32P] dATP bruke tilfeldig primer systemet, ifølge Smith 25.
- Incubate på 98 ° C for 30 s første rødsprit. Deretter utfører 35 sykluser på 98 ° C for 10 s, 60 ° C for 30 s og 72 ° C for 45 s. For endelig utvidelse, bruke 72 ° C for 10 min.
- Forberede total mobilnettet DNA i henhold til Løbner-Olesen og von Freiesleben 26 t = 0 og valgte tidspunkt før t = 700 anslått generasjoner konkurransen.
- Fordøye totale mobilnettet DNA med Pvu I, som skjærer NKBOR som inneholder regionen rundt en gang i en region ikke dekket av sonden; 1 enhet av Pvu jeg kan brukes til å fullstendig digest 1 µg av underlaget DNA.
Merk: Sonden gjenkjenner fragmenter som inneholder deler av transposon, sammen med chromosomal DNA av forskjellige lengder, avhengig av innsetting site. - Utfører en sørlige klatt bruker en 0,7% agarose gel etter Løbner-Olesen og von Freiesleben 26.
4. Identifikasjon av de Fittest kloner
- Bruk enkel genet gå, som beskrevet av Harrison et al. 27, identifisere DARS2 innsetting nettsteder fra enkelt kloner (isolert på LB plater) etter 700 anslagsvis generasjoner av konkurranse; de flere bandene på sørlige blot, mer isolert for å dekke alle transposon innsettinger.
- Isolere genomisk DNA for PCR-malen. Spre bakterier på en LB agar plate inneholder 50 µg/mL kanamycin og ruge på 37 ° C over natten. Vokse enkelt kolonier overnatter i LB sjy ved 37 ° C og deretter overføre 20 µL til 200 µL autoklaveres destillert vann (eller bruk DNA rensing, som i trinn 3.2).
- Vortex å blande. Varm blandingen ved 100 ° C for 10 min og sentrifuge på maks fart for 5 min. lagre cellen lysate på 20 ° C for fremtidig bruk.
- Design tre nestede primere for anneal i transposon ønsker (se figur 2 for en grafisk presentasjon av PCR strategi).
Merk: Utforme nestet primere sikrer at nestet Primer 3 ligger den kjente 5 ' slutten av transposon DNA, etterfulgt av nestede primere 2 og 1. Avstanden mellom nestet Primer 3 og 5 ' slutten av kjente transposon DNA burde være nok for en sekvens lese gjennom fra kjente DNA til ukjent DNA (for å finne bestemte chromosomal transposon innsetting site). NKBOR følgende nestede primerne ble brukt: pNKBOR_Nested3_RV: gcagggctttattgattcca, pNKBOR_Nested2_RV: tcagcaacaccttcttcacg, og pNKBOR_Nested1_RV: actttctggctggatgatgg. Tilfeldig primere med webområdene anerkjennelse av kjente begrensning enzymer brukes også. For å sikre et resultat, bør man bruke minst to forskjellige tilfeldige primere. Begrensning nettstedene for begrensning enzymer (e.g.,Sau 3AI og Hin dIII) skal plasseres på 3 ' ende og innledes med ti tilfeldige baser så som 5 ' - NNNNNNNNNNGATC - 3 ' og 5 ' - NNNNNNNNNNAAGCTT - 3 ' er primerne inneholder en Sau 3AI nettsted (GATC) og en Hin dIII nettsted (AAGCTT), henholdsvis der N = A, T, G eller C. - Bruk 200 ng genomisk DNA en 20 µL PCR reaksjon. Ruge på 98 ° C for 30 s for det første rødsprit. Utføre 25 sykluser på 98 ° C for 30 s, 50 ° C for 15 s og 72 ° C i 4 min. For endelig utvidelse, bruke 72 ° C for 10 min. Bruk primer par nestet Primer 1 og en tilfeldig primerne.
- Bruker primer par nestet Primer 2 og den samme tilfeldige primeren fra andre forsterkning, bruke 1 µL av sin tidligere reaksjon som mal.
- Gjenta trinn 4.1.4 med primer par nestet Primer 3 og den samme tilfeldige primeren.
- Kjøre produktene fra siste PCR reaksjonen på 1,5% agarose gel og beis med ethidium bromide. Klippe ut et band i området 100-800 bp og isolere DNA ved hjelp av noen kommersielle DNA gel utpakking kit ifølge produsenten ' s retning. Resuspend DNA i 15 µL vann.
Merk: forsiktig. Ethidium bromide er giftig og må håndteres med forsiktighet. - Rekkefølge bandet isolert i forrige trinn (trinn 4.1.6), med nestede Primer 3 som sekvensering primer, med Sanger sekvensering på en kommersiell leverandør.
- Isolere genomisk DNA for PCR-malen. Spre bakterier på en LB agar plate inneholder 50 µg/mL kanamycin og ruge på 37 ° C over natten. Vokse enkelt kolonier overnatter i LB sjy ved 37 ° C og deretter overføre 20 µL til 200 µL autoklaveres destillert vann (eller bruk DNA rensing, som i trinn 3.2).
- Utføre WGS.
- Utføre WGS på totalt DNA utvunnet fra valgt prøver samlet under konkurransen eksperimentet, som beskrevet av Frimodt-Møller et al 4.
- Utføre sekvensering analyse.
- Juster sammen-end leser til 150 Ns sammenhengende til NKBOR, AF310136.1 1,904 … 2,204 med et intervall mellom frø delstrenger (S, 1, 1.15) og et maksimalt antall tvetydig tegn (L, 0, 0,9) Bowtie2 28.
- Velg den justerte lest og deretter re-align til begge MG1655 ref | NC_000913.3 og NKBOR gb | AF310136 bruker blastN 29
- Tilordne transponering innsetting stillinger ved veikryss MG1655-NKBOR.
5. Flow cytometri
- prøver for flowcytometri.
- Balanse hver kultur ved å opprettholde det i eksponensiell vekstfase i minst 10 generasjoner. Sjekk OD 600 og sikre at det aldri overstiger 0,3.
- Samle to typer flyt prøver.
- For RIF-avvik, overføre 1 mL av kultur til en 15 mL tube som inneholder 30 µL av RIF-CEF (300 µg/mL og og 36 µg/mL cephalexin oppløst i 12.5 mM NaOH). La den på 37 ° C i minst 4 h risting.
Merk: Og indirekte blokkerer initiering av kromosom replikering samtidig som for pågående runder med replikering fortsette å avsluttes. Cephalexin forhindrer cellen divisjon, som resulterer i replikering avvik (RIF-avvik) og akkumulering av celler med fullt replikert kromosomer. Antall fullt replikert kromosomer er lik antall opprinnelse ved behandling med og og cephalexin 20. - For EXP-prøven, overføre 1 mL av eksponensielt voksende kultur til en 1.5-mL tube på ice.
- For RIF-avvik, overføre 1 mL av kultur til en 15 mL tube som inneholder 30 µL av RIF-CEF (300 µg/mL og og 36 µg/mL cephalexin oppløst i 12.5 mM NaOH). La den på 37 ° C i minst 4 h risting.
- Fikse cellene som følger. Høste celler med sentrifugering 15.000 x g i 5 min på 4 ° C. Resuspend pellet i 100 µL av iskalde 10 mM Tris pH 7.5 og legge 1 mL av iskalde 77% etanol. Lagre prøver på 4 ° C før bruk.
- Stain cellene som følger. Høste 100-300 µL av fast celler med sentrifugering 15.000 x g i 15 min. Fjern nedbryting og resuspend pellet i 130 µL av " DNA flekker løsning " (90 µg/mL mithramycin 20 µg/mL ethidium bromide, 10 mM MgCl 2 og 10 mM Tris pH 7.5). Sett prøvene på is og i mørket; prøvene er klar for flyt cytometri analyse etter 10 min.
Merk: Andre DNA flekker enn ethidium bromide og mithramycin kan også være brukt 30 , 31. - Fastslå opprinnelsen per celle, den relative cellemasse og relativ DNA innholdet av flyt cytometri analyse.
- Utføre flowcytometri, som beskrevet tidligere 32. RIF-avvik og EXP-prøver ved å bruke flyt cytometer produsenten ' s instruksjoner . Mithramycin- og ethidium bromide-farget celler, bruker eksitasjon bølgelengder 395 og 440 nm og samle fluorescens over 565 nm.
- å fastslå relativ masse og relative DNA celleinnholdet, kjøre EXP-prøvene å få enkelt-parameteren frem lys scatter versus celle nummer histogrammer og fluorescens intensitet versus celle nummer histogrammer for minimum 30.000 hendelser tilsvarende cellen signalet.
- Bruk frem-spredt lys enkelt-parameteren distribusjon å måle den gjennomsnittlige relative celle Mass
Merk: Fremover-spredt lys er et mål på den gjennomsnittlige celle masse 20. - Bruk fluorescens intensitet én-parameteren distribusjoner å måle gjennomsnittlig DNA innhold 20.
- Få DNA konsentrasjonen som forholdet av gjennomsnittlig DNA innhold til gjennomsnittlig cellen masse 20.
- Bestemme antall opprinnelse per celle.
- Kjøre RIF-avvik prøver å få én-parameteren fluorescens intensitet versus celle nummer histogrammer for minimum 30.000 hendelser tilsvarende cellen signalet.
- Bruk fluorescens intensitet én-parameteren distribusjoner å bestemme antall kromosomer i hver celle 20.
- Utføre flowcytometri, som beskrevet tidligere 32. RIF-avvik og EXP-prøver ved å bruke flyt cytometer produsenten ' s instruksjoner . Mithramycin- og ethidium bromide-farget celler, bruker eksitasjon bølgelengder 395 og 440 nm og samle fluorescens over 565 nm.
- Beregner asynchrony indeksen (Ai).
- Beregn Ai, som beskrevet av Løbner-Olesen et al. 32, bruker fluorescens intensitet enkelt parameter distribusjonen av RIF-avvik prøver og formel Ai = (f3 + f5 + f6 + f7) / (f2 + f4 + f8), der fx er brøk cellene med x antall fullt replikert kromosomer. Vurdere innvielser asynkron når A > 0.1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En sørlige klatt ble gjort for å bekrefte at DARS2 ble distribuert tilfeldig gjennom kromosomet i transposon biblioteket (t = 0) og som fittest kloner ville vedvarer over tid. Sørlige blot ble utført på DNA utvunnet fra første transposon bassenget (på t = 0) og hver anslagsvis 100 av 700 generasjoner konkurransen (Figur 3). Her totale mobilnettet DNA fra hvert tidspunkt var fordøyd med Pvujeg begrensning enzym, kjent for å kutte transposon NKBOR::DARS2 når bare i et område som ikke dekkes av sonden. Sørlige blot undersøkt med et radioactively merket DNA fragment komplementær til en del av NKBOR. Sett fra Figur 3første DARS2 bassenget (t = 0) manglet forskjellige band, som viser at DARS2 ble satt tilfeldig gjennom kromosomet. Over tid, en mønster dukket opp der det første store bassenget DARS2 kloner utviklet seg til bare én eller noen få vedvarende DARS2 kloner (Figur 3; t = 0, t = 700).
I eksempelet ble DARS2 innsetting nettsteder fra konkurransen eksperimentet identifisert WGS og enkel genet gangavstand. Her WGS ble brukt til å identifisere innsetting nettsteder fra starten bassenget (t = 0) og etter 300, 400 og 700 generasjoner av konkurransen. Merk at dekningen i den nåværende dype sekvensering var utilstrekkelig for en fullstendig kartlegging av innsetting på t = 0; men gir det et representativt delsett av antall innsettinger. WGS bekreftet sørlige blot resultatet (dvs. valg av fittest DARS2 kloner), med ca 98% av alle DARS2 innsettinger nær wildtype DARS2 chromosomal plassering (DARS2 Klone IR og klone rppH), mens de resterende 2% var andre steder på kromosomet (Figur 4). Dette antyder sterkt at wildtype er optimal for DARS2 funksjon. Ved t = 400, en innsetting ble funnet på motsatt replikering arm med en nesten identisk avstanden til oriC som wildtype DARS2 posisjon (Figur 4), men denne innsetting ble ikke gjenopprettet etter 700 generasjoner. Dermed kan ikke replikering-assosiert genet dosering være den eneste Determinanten for optimal posisjon.
Enkel genet gå ble brukt til å identifisere DARS2 innsettinger områder i én kloner isolert etter 700 anslagsvis generasjoner konkurransen. Her, ble de to DARS2 innsetting områdene nevnt ovenfor (DARS2 klone IR og klone rppH) identifisert. Enkel genet gå ble bare gjort på 20 kloner, og dette forklarer hvorfor alle DARS2 innsettinger områder kartlagt i WGS ikke ble identifisert. DARS2-mangelfull celler ble tidligere vist å starte replikasjon i asynchrony og ha en nedgang i opprinnelse konsentrasjon i forhold til wildtype cellene4,16,17, 18. vi derfor brukt flowcytometri å løse synkronisering i initiering av DNA-replikasjon og cellular opprinnelse innhold for de to valgte stammene (DARS2 klone IR og klone rppH) som i begge tilfeller ble gjenopprettet til wildtype nivåer (figur 5). Et representativt eksempel belastning har én kopi av DARS2 i terminus vises (figur 5E). Her, gjenoppretter tilstedeværelse av et DARS2 -element i terminus ikke synkronisering eller cellular opprinnelse innholdet til wildtype nivåer, mens den valgte DARS2 kloner IR og rppH gjøre.
Figur 1 : Metodikk oversikt. Skjematisk presentasjon av metodikken. Chromosomal DARS2 regionen er klonet i mini Tn10 på pNKBOR, å lage pJFM1. pJFM1 er forvandlet til E. coli MG1655 ΔDARS2, som utløser en tilfeldig innsetting av DARS2 knyttet til Tn10 på kromosomet av E. coli MG1655 ΔDARS2. Ca 70.000 kloner, hver inneholder en annen chromosomal DARS2 innsetting, var samlet og konkurrerte direkte mot hverandre i LB kjøttkraft på 37 ° C. Direkte konkurranse eksperimentet i LB buljong ble utført for en anslått 700 generasjoner, der et utvalg ble isolert for hver 100 generasjoner av direkte konkurranse. Totalt DNA ble trukket ut fra hver isolert prøve og brukes for Southern blotting og identifisering av DARS2 innsettinger WGS. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Grafisk fremstilling av enkel genet gå. Denne illustrasjonen viser en genomisk DNA mal av en ukjent DNA sekvens tilstøtende til en kjent sekvens med grunning nettsteder for tilfeldig primer og Nøstet primere 1, 2 og 3. Resultatene av de tre påfølgende amplifications utføres med tre designet nestede primerne er illustrert nedenfor. Det endelige produktet (fra runde 3) er sekvensielt ved hjelp av nestede Primer 3. Dette tallet ble tilpasset fra Harrison et al. 27. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Sørlige blot analysert for NKBOR. Sørlige blot analyse av DARS2 innsettinger i en DARS2-mangelfull belastning. Genomic DNA utdraget fra hver ~ 100 generasjoner i direkte konkurranse, starter på t = 0 og slutter på 700 generasjoner, var fordøyd med Pvujeg og gel-fraksjonert. Blot ble hybridiserte med en NKBOR undersøke (se Protocol). t angir antall generasjoner av konkurransen. Dette tallet ble tilpasset fra Frimodt-Møller et al. 4. HMW og LMW er høy-molekylær vekt og lav-molekylær vekt DNA, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Grafisk representasjon av løseEd transposon innsettinger områder i ΔDARS2. Plasseringen av oriC, datA, DARS1, DARS2, og terC . DARS2 innsetting områder i ΔDARS2 på t = 0 (stenger), t = 400 (lys blå barer), t = 500 (røde barer), og t = 700 (grønne barer), løses ved full-genome sekvensering. Denne illustrasjonen ble laget med DNAPlotter33 og var tilpasset fra Frimodt-Møller et al. 4. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5 : Representant flyt cytometri histogrammer for transposon nettsteder funnet av enkel genet gå på t = 700. Cellene ble dyrket i AB minimal medium med 0,2% glukose, 10 µg/mL Thiamin og 0,5% casamino syrer på 37 ° C. Wildtype og ΔDARS2 vises i A og B, henholdsvis. Derivater av wildtype belastningen MG1655 uten DARS2 opprinnelige locus og i stedet bærer en kopi av DARS2 på løst transposon nettstedet rrpH, IR og endeholdeplassen (terC) vises i C, D og E, henholdsvis. Dette tallet ble tilpasset fra Frimodt-Møller et al. 4 vise en DARS2 plassering som resulterer i en celle syklus avvik (terC) eller som gjenoppretter wildtype fenotypen(rrpH, IR). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Metodene som er brukt her utnytter state-of-the-art teknikker for å svare på en vanskelig spørsmål angående den optimale genomisk posisjonen av en genetisk element. Tilfeldige innsetting av genetisk elementet (formidlet av transposon) muliggjør rask og enkel innsamling av kloner, som deretter kan gjøres å konkurrere mot hverandre til å velge for den optimale posisjonen undersøkte genetisk elementet (dvs. fittest klone).
Her DARS2 ble satt inn i mini-Tn10-basert transposon, NKBOR. Valg av transposon er viktig for nedstrøms analyse av innsettinger nettsteder. Flere forskjellige transposons har blitt brukt i transposon-rettet innsetting-området sekvensering (TraDIS) eksperimenter, som mini-Tn5Km234 og mer populært valg, Himar jeg Mariner transposon35, 36 (for en siste gjennomgang av dette, se van Opijnen og Camilli-36). Vi rettet for 70.000 første tilfeldig innsettinger av DARS2, som gir ca en DARS2 innsetting evert 65 bp i MG1655 genomet. Dette kan enkelt justeres ved å redusere eller øke den innledende pool på koloniene samlet.
Her vi valgte for kontinuerlig overføringer i LB satsvise kulturer, men konkurransen eksperimentet kan også utføres i et annet medium eller under ulike forhold, inkludert bruk av en chemostat37. Videre kan fremgangsmåten endres for å imøtekomme eventuelle vilkår for valg, inkludert ulike påkjenninger, for eksempel oksidativt, osmotisk eller antibiotika stress. For å bekrefte tilstedeværelse av vedvarende kloner over tid, kan man gjøre tre ting: WGS; Transposon sekvenser (Tn-Seq); eller, som her, en Sør Blot. Til slutt, enkel genet gå kan gjøres på noen kloner, med videre fordel at transposon innsetting nettsteder er identifisert i enkelt kloner, slik at effekten av spesifikke innsetting site svært kan analyseres.
Valg av fenotypiske analysen vurdere utfallet av en konkurranse eksperiment, avhengig av regionen undersøkt. Vi brukte flowcytometri, som er en kraftig metode for å måle cellen syklus parametere av bakterier. Her avslørt flowcytometri at den valgte chromosomal stillingen(e) av DARS2, (dvs. DARS2 innsettinger nær wildtype DARS2 posisjon) resulterte i riktig regulering av replikering innvielse ( dvs, synkronisering og DNA konsentrasjon). De optimale chromosomal stillingen(e) for DARS2 ble valgt delvis grunn riktig replikering-assosiert genet dosering og delvis på grunn av det gunstige lokale genomisk miljøet som er viktig for DARS2 funksjon4.
Her et ikke-koding DNA-element ble undersøkt, men dette kunne utvides til alle koding område av valg. En fersk studie fant at nivået av genuttrykk varierte ~ 300-fold, avhengig av posisjonen på kromosomet, uten fjerner sammenheng med replikering-assosiert genet dosering38. Tilnærmingen beskrevet her kan gi viktig innsikt i forholdet mellom genomisk plasseringen til et bestemt gen, sin transcriptional aktivitet og tilhørende fitness fordelen. Dette kan i teorien hjelpe med valg av genomisk posisjoner, som fører til sterkere uttrykk for en gitt genet, som igjen kan være av interesse for teknisk ny, forbedret stammer for rekombinante proteiner produksjon.
Fordi E. coli inneholder begrenset intergenisk områder39, vil transposon innsettinger i de fleste tilfeller, forstyrre gene(s). Dette kan noen ganger opprette falske positiver der de fittest clone(s) ikke er valgt på grunn av optimale chromosomal plasseringen av genetisk element i spørsmålet, men heller fordi et gen avbrytes - som på andre måter, gir en fitness fordel under den konkurranse eksperiment4.
Denne metodikken drar nytte av en lett-å-bruke transposon system, der alle område av valg kan være integrert tilfeldige steder. Designet konkurranse eksperimentet kan endres for å inkludere en rekke utvalg styrker enn ren vekst, som her. Oppsettet kan også endres for å være utelukkende basert på Tn-Seq, som gir en større sekvensering oppløsning innsettinger nettsteder enn WGS, brukes her. Denne upartiske tilnærming bør brukes til å belyse spennende nye funksjoner så langt uncharacterized organismer, som kan vise at felles trender finnes i fylker av Eubacteria.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen konkurrerende økonomisk interesse.
Acknowledgments
Forfatterne var finansiert gjennom tilskudd fra Novo Nordisk grunnlaget, Lundbeck grunnlaget og danske National Research Foundation (DNRF120) gjennom Center for bakteriell Stress og utholdenhet (BASP.net).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Autoclaved Mili-Q water | None | ||
| Electroporation Cuvettes, 0.1 cm | Thermo Fisher Scientific | P41050 | |
| Bio-Rad MicroPulser Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | |
| LB Broth | Thermo Fisher Scientific | 12780029 | |
| LB Agar, powder (Lennox L agar) | Thermo Fisher Scientific | 22700025 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | 17904 | |
| Fisherbrand Plastic Petri Dishes | Fisher Scientific | S33580A | |
| Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| Nunc CryoTubes | Sigma-Aldrich | V7634 | |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase (2 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | F530S | |
| dATP, [α-32P]- 3000Ci/mmol 10mCi/ml, 250 µCi | PerkinElmer | BLU012H250UC | |
| DECAprime II DNA Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1455 | |
| Spectrophotometer SF/MBV/03.32 | Pharmacia | ||
| Hermle Centrifuge SF/MBV/03.46 | Hermle | ||
| Ole Dich Centrifuge SF/MBV/03.29 | Ole Dich | ||
| Eppendorftubes 1.5 mL | Sigma-Aldrich | T9661 | |
| Eppendorftubes 2.0 mL | Sigma-Aldrich | T2795 | |
| Sodium Chloride | Merck | 6404 | |
| 96% Ethanol | Sigma-Aldrich | 16368 | |
| Trizma HCl | Sigma-Aldrich | T-3253 | |
| Phenol Ultra Pure | BRL | 5509UA | |
| Chloroform | Merck | 2445 | |
| Ribonuclease A type II A | Sigma-Aldrich | R5000 | |
| Sodiumdodecylsulphate (SDS) | Merck | 13760 | |
| Lysozyme | Sigma-Aldrich | L 6876 | |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 405-7 | |
| 0.5M Na-EDTA pH 8.0 | BRL | 5575 UA | |
| Kanamycin sulfate | Sigma-Aldrich | 10106801001 | |
| PvuI (10 U/µL) | Thermo Fisher Scientific | ER0621 | |
| UltraPure Agarose | Thermo Fisher Scientific | 16500500 | |
| DNA Gel Loading Dye (6X) | Thermo Fisher Scientific | R0611 | |
| Tris-Borate-EDTA buffer | Sigma-Aldrich | T4415 | |
| Ethidium bromide | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 433160 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 71687 | |
| Whatman 3MM papers | Sigma-Aldrich | WHA3030931 | |
| SSC Buffer 20× Concentrate | Sigma-Aldrich | S6639 | |
| Amersham Hybond-N+ | GE Healthcare | RPN119B | |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F8016 | |
| Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP40 | |
| Bovine Serum Albumin - Fraction V | Sigma-Aldrich | 85040C | |
| Deoxyribonucleic acid sodium salt from salmon testes | Sigma-Aldrich | D1626 | |
| Carestream Kodak BioMax light film | Sigma-Aldrich | Z373494 | |
| GenElute Gel Extraction Kit | Sigma-Aldrich | NA1111 | |
| GenElute PCR Clean-Up Kit | Sigma-Aldrich | NA1020 | |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad | ||
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | ||
| Rifampicin | Serva | 34514.01 | |
| Cephalexin | Sigma-Aldrich | C4895 | |
| Mithramycin | Serva | 29803.02 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | 246964 | |
| Apogee A10 instrument | Apogee |
References
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Lobner-Olesen, A. Control of bacterial chromosome replication by non-coding regions outside the origin. Curr Genet. , (2016).
- Sherratt, D. J., et al. Recombination and chromosome segregation. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 359 (1441), 61-69 (2004).
- Bigot, S., et al. DNA motifs that control E. coli chromosome segregation by orienting the FtsK translocase. EMBO J. 24 (21), 3770-3780 (2005).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. DNA Replication Control Is Linked to Genomic Positioning of Control Regions in Escherichia coli. PLoS Genet. 12 (9), 1006286 (2016).
- Kornberg, A., Baker, T. A. DNA Replication, Second Edition. , University Science Books. (1992).
- Kaguni, J. M. Replication initiation at the Escherichia coli chromosomal origin. Curr Opin Chem Biol. 15 (5), 606-613 (2011).
- Leonard, A. C., Grimwade, J. E. Regulation of DnaA assembly and activity: taking directions from the genome. Annu Rev Microbiol. 65, 19-35 (2011).
- Kurokawa, K., Nishida, S., Emoto, A., Sekimizu, K., Katayama, T. Replication cycle-coordinated change of the adenine nucleotide-bound forms of DnaA protein in Escherichia coli. EMBO J. 18 (23), 6642-6652 (1999).
- Sekimizu, K., Bramhill, D., Kornberg, A. ATP activates dnaA protein in initiating replication of plasmids bearing the origin of the E. coli chromosome. Cell. 50 (2), 259-265 (1987).
- Brendler, T., Austin, S. Binding of SeqA protein to DNA requires interaction between two or more complexes bound to separate hemimethylated GATC sequences. EMBO J. 18 (8), 2304-2310 (1999).
- Lu, M., Campbell, J. L., Boye, E., Kleckner, N. SeqA: a negative modulator of replication initiation in E. coli. Cell. 77 (3), 413-426 (1994).
- Katayama, T., Kubota, T., Kurokawa, K., Crooke, E., Sekimizu, K. The initiator function of DnaA protein is negatively regulated by the sliding clamp of the E. coli chromosomal replicase. Cell. 94 (1), 61-71 (1998).
- Kato, J., Katayama, T. Hda, a novel DnaA-related protein, regulates the replication cycle in Escherichia coli. EMBO J. 20 (15), 4253-4262 (2001).
- Kasho, K., Katayama, T. DnaA binding locus datA promotes DnaA-ATP hydrolysis to enable cell cycle-coordinated replication initiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (3), 936-941 (2013).
- Kitagawa, R., Ozaki, T., Moriya, S., Ogawa, T. Negative control of replication initiation by a novel chromosomal locus exhibiting exceptional affinity for Escherichia coli DnaA protein. Genes Dev. 12 (19), 3032-3043 (1998).
- Fujimitsu, K., Senriuchi, T., Katayama, T. Specific genomic sequences of E. coli promote replicational initiation by directly reactivating ADP-DnaA. Genes Dev. 23 (10), 1221-1233 (2009).
- Kasho, K., Fujimitsu, K., Matoba, T., Oshima, T., Katayama, T. Timely binding of IHF and Fis to DARS2 regulates ATP-DnaA production and replication initiation. Nucleic Acids Res. 42 (21), 13134-13149 (2014).
- Frimodt-Moller, J., Charbon, G., Krogfelt, K. A., Lobner-Olesen, A. Control regions for chromosome replication are conserved with respect to sequence and location among Escherichia coli strains. Front Microbiol. 6, 1011 (2015).
- Bergthorsson, U., Ochman, H. Distribution of chromosome length variation in natural isolates of Escherichia coli. Mol Biol Evol. 15 (1), 6-16 (1998).
- Boye, E., Steen, H. B., Skarstad, K. Flow cytometry of bacteria: a promising tool in experimental and clinical microbiology. J Gen Microbiol. 129 (4), 973-980 (1983).
- Rossignol, M., Basset, A., Espeli, O., Boccard, F. NKBOR, a mini-Tn10-based transposon for random insertion in the chromosome of Gram-negative bacteria and the rapid recovery of sequences flanking the insertion sites in Escherichia coli. Res Microbiol. 152 (5), 481-485 (2001).
- SHIGEN. , Available from: http://shigen.nig.ac.jp (2017).
- Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
- Gonzales, M. F., Brooks, T., Pukatzki, S. U., Provenzano, D. Rapid protocol for preparation of electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae. J Vis Exp. (80), (2013).
- Smith, D. R.
- Lobner-Olesen, A., von Freiesleben, U. Chromosomal replication incompatibility in Dam methyltransferase deficient Escherichia coli cells. EMBO J. 15 (21), 5999-6008 (1996).
- Harrison, R. W., Miller, J. C., D'Souza, M. J., Kampo, G.
- Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
- Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).
- Stepankiw, N., Kaidow, A., Boye, E., Bates, D. The right half of the Escherichia coli replication origin is not essential for viability, but facilitates multi-forked replication. Mol Microbiol. 74 (2), 467-479 (2009).
- Lobner-Olesen, A. Distribution of minichromosomes in individual Escherichia coli cells: implications for replication control. EMBO J. 18 (6), 1712-1721 (1999).
- Lobner-Olesen, A., Skarstad, K., Hansen, F. G., von Meyenburg, K., Boye, E. The DnaA protein determines the initiation mass of Escherichia coli K-12. Cell. 57 (5), 881-889 (1989).
- Carver, T., Thomson, N., Bleasby, A., Berriman, M., Parkhill, J. DNAPlotter: circular and linear interactive genome visualization. Bioinformatics. 25 (1), 119-120 (2009).
- Eckert, S. E., et al. Retrospective application of transposon-directed insertion site sequencing to a library of signature-tagged mini-Tn5Km2 mutants of Escherichia coli O157:H7 screened in cattle. J Bacteriol. 193 (7), 1771-1776 (2011).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Jeong, H., Lee, S. J., Kim, P. Procedure for Adaptive Laboratory Evolution of Microorganisms Using a Chemostat. J Vis Exp. (115), (2016).
- Bryant, J. A., Sellars, L. E., Busby, S. J., Lee, D. J. Chromosome position effects on gene expression in Escherichia coli K-12. Nucleic Acids Res. 42 (18), 11383-11392 (2014).
- Blattner, F. R., et al. The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
