Bildgebung der Wurzelhaare Morphologie der Arabidopsis Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform
Summary
Dieser Artikel veranschaulicht, wie Arabidopsis Thaliana Sämlinge in einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform Kultur, die die Hauptwurzel und Wurzelhaare zu einer optischen Ebene beschränkt. Diese Plattform kann für Echtzeit-optische Bildgebung der feinen Wurzel Morphologie als auch für hochauflösende Bildgebung mit anderen Mitteln verwendet werden.
Abstract
Wurzelhaare erhöhen Wurzel Oberfläche für bessere Wasseraufnahme und Nährstoffaufnahme durch die Pflanzen. Weil sie klein und oft verdeckt von ihrer natürlichen Umgebung sind, sind Wurzelhaare Morphologie und Funktion schwer zu studieren und Pflanzenforschung oft ausgeschlossen. In den letzten Jahren haben mikrofluidischen Plattformen eine Möglichkeit, Wurzelsysteme mit hoher Auflösung sichtbar zu machen, ohne die Wurzeln zu stören, während der Übertragung um ein bildgebendes System angeboten. Mikrofluidischen Plattform präsentiert hier baut auf bisherigen Anlage-on-a-Chip-Forschung, durch den Einbau einer Zweischicht-Gerät um die Arabidopsis Thaliana Hauptwurzel, die gleichen optischen Ebene als die Wurzelhaare beschränken. Dieses Design ermöglicht die Quantifizierung der Wurzelhaare auf ein Handy und Organelle Ebene und auch verhindert, dass z-Achse treiben während der Zugabe von experimentellen Behandlungen. Wir beschreiben, wie die Geräte in einer geschlossenen und hydratisiert Umgebung, ohne die Notwendigkeit für fluidische Pumpen, unter Beibehaltung einer gnotobiotischen Umgebung für den Keimling zu speichern. Nach dem optischen Bildgebung Experiment werden das Gerät zerlegt und als Substrat für Rasterkraftmikroskop oder Rasterelektronenmikroskopie während feine Wurzel Strukturen intakt zu halten verwendet.
Introduction
Feine Wurzel Funktionen erhöhen Wasser und Nährstoff Erwerb für die Pflanze neue Erde Räume zu erforschen und Vergrößerung der Oberfläche total Wurzel. Der Umsatz dieser feinen Wurzel Funktionen spielt eine wichtige Rolle bei der Stimulierung der unterirdischen Nahrungskette1 und die Anzahl der Feinwurzeln in bestimmten Pflanzenarten ist unter erhöhten atmosphärischen Kohlendioxyd verdoppeln2. Feinwurzeln sind in der Regel als jene kleiner als 2 mm im Durchmesser, definiert, obwohl neue Definitionen für die Charakterisierung von Feinwurzeln durch ihre Funktion3befürworten. Wie viele Feinwurzeln Wurzelhaare erfüllen die Funktion der Aufnahme und Absorption aber einen viel kleineren Raum mit Durchmessern in der Größenordnung von Mikrometern zu besetzen. Aufgrund ihrer geringen Größe Wurzelhaare sind schwer zu Bild in Situ und werden oft als Teil der Gesamtarchitektur der Wurzel im Feld Skalierung Experimente und Modelle übersehen.
Ex-Terra Wurzelhaare Studien, z. B. Sämlinge auf Agarplatten gewachsen, haben hat die wissenschaftliche Gemeinschaft mit wertvollen Informationen auf Zellwachstum und Transport4,5. Während Agarplatten Wurzelsysteme, zerstörungsfrei und in Echtzeit abgebildet werden können, bieten sie nicht hohe Umweltkontrolle für den Zusatz von experimentellen Behandlungen wie Nährstoffe, Pflanzenhormone oder Bakterien. Eine neue Lösung für hochauflösende Bildgebung, wobei jedoch auch dynamische Umwelt Kontrolle erleichtern seit dem Aufkommen von mikrofluidischen Plattformen für Pflanze Studien. Diese Plattformen haben die nicht-destruktive Wachstum und Visualisierung von mehreren Pflanzenarten für hohen Durchsatz Phänotypisierung6,7,8,9, isolierte chemische Behandlungen ermöglicht. 10, Force Messungen11,12, und die Zugabe von Mikroorganismen13. Mikrofluidischen Plattform Entwürfe konzentrierten sich auf die Verwendung von einzelnen Freifläche fluidische Schichten, in denen die Wurzeln ausbreiten können, erlaubt die Wurzelhaare, ein-und optischen Schwerpunkt während des Wachstums oder Behandlung zu treiben.
Hier präsentieren wir ein Verfahren zur Entwicklung einer zweischichtigen mikrofluidischen Plattform mit Foto und Soft-Lithografie-Methoden, die auf früheren Pflanze-on-a-Chip-Designs durch die Beschränkung der Sämling Wurzelhaare, die gleichen Abbildungsebene als die Hauptwurzel aufbaut. Dies ermöglicht es uns, Wurzelhaare Entwicklung in Echtzeit, mit hoher Auflösung und Verlauf der experimentellen Behandlung zu verfolgen. Unsere Kultivierung Methoden ermöglichen Arabidopsis Thaliana Sämlinge gekeimt werden aus Samen innerhalb der Plattform und kultivierten für bis zu einer Woche in einer hydratisiert und sterile Umgebung, die nicht die Verwendung von Spritze Pumpe Ausrüstung erfordert. Einmal das Zeitraffer Image Experiment abgeschlossen hat, kann die hier vorgestellten Plattform geöffnet werden, ohne zu stören die Position der feineren Wurzel Merkmale. Dies ermöglicht die Verwendung von anderen hochauflösenden bildgebenden Verfahren. Hier bieten wir repräsentative Ergebnisse für die Quantifizierung und Visualisierung der Wurzelhaare Morphologie in dieser Plattform durch optische, Scan-Elektronen-Mikroskopie (SEM) und Rasterkraftmikroskop Mikroskopiertechniken (AFM).
Protocol
Representative Results
Discussion
Schaffung einer Pflanze-on-a-Chip-Plattform in diesem Artikel beschriebene Verfahren ist einzigartig, da die Zweischicht-design Grenzen der Wurzelhaare zum einzigen Abbildungsebene und der Plattform dekonstruiert und als Substrat für nichtoptische hochauflösende Bildgebung verwendet werden . Mit hoher Auflösung nicht optische Bildgebung bieten wertvolle Informationen über das Pflanzengewebe, die aus optischen Bildgebung allein nicht erreicht werden konnten. Zum Beispiel bieten AFM Bildgebung Kraftmessungen um die Ela…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Handschrift hat von UT-Battelle, LLC unter Vertrag Nr. verfasst worden DE-AC05-00OR22725 mit dem US-Department of Energy. Behält sich die Regierung der Vereinigten Staaten und der Verlag durch die Annahme des Artikels zur Veröffentlichung, räumt ein, dass die US-Regierung eine nichtausschließliche eingezahlte, unwiderrufliche, weltweite Lizenz behält zu veröffentlichen oder zu reproduzieren das veröffentlichte Formular der Diese Handschrift, oder andere zu tun, für die Zwecke der US-Regierung zu ermöglichen. Das Department of Energy wird den Zugang der Öffentlichkeit zu diesen Ergebnissen der vom Bund geförderten Forschung gemäß dem DOE den Zugang der Öffentlichkeit Plan (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) zur Verfügung stellen.
Diese Arbeit wurde zum Teil von Genomic Science Program, U.S. Department of Energy, Office of Science, biologische und Umweltforschung, als Teil der Mikrobe Schnittstellen wissenschaftlicher Fokus Betriebsfläche (http://pmi.ornl.gov) unterstützt. Die Herstellung von mikrofluidischen Plattformen Nanofabrikation Research Laboratory in der Mitte für Anwendungspotential Materialwissenschaften erfolgte in eine Damhirschkuh Büro der Wissenschaft Benutzer Anlage. JAA ist durch eine NSF graduate Research Fellowship DGE-1452154 unterstützt.
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
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