Kök saç Morfoloji Arabidopsis fidan bir iki katlı mikrosıvısal platformda görüntüleme
Summary
Bu makalede, ana kök ve kök tüyleri tek bir optik uçağı için confines bir iki katlı mikrosıvısal platformda Arabidopsis thaliana fidan kültür gösterilmiştir. Bu platform iyi kök morfolojisi de yüksek çözünürlüklü görüntüleme gelince gerçek zamanlı optik görüntüleme için başka araçlar tarafından kullanılabilir.
Abstract
Kök tüyleri daha iyi su alımı ve bitki besin emilimi için kök yüzey alanını artırır. Küçük boyutlu ve sık sık doğal çevreleri tarafından obscured oldukları için kök saç morfoloji ve işlev çalışmaya zor ve genellikle bitki araştırmaları dışında. Son yıllarda mikrosıvısal platformlar kök sistemleri yüksek çözünürlükte görüntüleme sistemine aktarımı sırasında kökleri bozmadan görselleştirmek için bir yol teklifinde bulundular. Önceki bitki-on-a-chip araştırma burada sunulan yapılar Arabidopsis thaliana ana kök kök tüyleri olarak aynı optik uçağa sınırlamak için bir iki katlı aygıt dahil ederek mikrosıvısal platformu. Bu tasarım bir cep üzerinde kök tüyler miktar etkinleştirir ve organel düzeyde ve aynı zamanda deneysel tedaviler eklenmesi sırasında sürüklenen z ekseni engeller. Belgili tanımlık aygıt ezelî belgili tanımlık lüzum için Akışkan pompalar, fide için bir gnotobiotic ortamı korurken bir içerilen ve sulu ortamda saklamak açıklanmıştır. Optik görüntüleme deneyden sonra aygıtın demonte ve Atomik kuvvet veya elektron mikroskobu tarama iyi kök yapıları olduğu gibi tutmak için bir substrat kullanılır.
Introduction
İyi kök özellikleri su ve besin alımı için yeni toprak alanlarda keşfetmek ve toplam kök yüzey alanı artan tesisi, artış. Bu iyi kök özellikler ciro yeraltı gıda zinciri1 uyarıcı bir önemli rol oynar ve iyi bazı bitki türleri kökleri beklenen yüksek atmosferik karbon dioksit altında çift2sayısıdır. Her ne kadar iyi kökleri onların işlevi3tarafından karakterize için yeni tanımları savunucusu iyi kökleri genellikle olanlar kadar 2 mm çapında, daha küçük tanımlanır. Gibi pek çok iyi kökleri, kök tüyleri alımı ve emme işlevi sağlar, ancak mikron sırasına fan çapı daha küçük bir yer işgal. Kendi küçük boyutu nedeniyle kök kılları için görüntü içinde situ zordur ve genellikle alan ölçekli deneyler ve modelleri genel kök mimarisinde bir parçası olarak gözden.
Terra ex kök saç çalışmalar, böyle Ağar kaplamalar üzerinde yetiştirilen Fideler itibaren bilimsel topluluk ile hücresel büyüme ve taşıma4,5değerli bilgiler sağladı. Ağar kaplamalar kök sistemleri dönüşlü ve gerçek zamanlı olarak yansıması için izin verirken, besin, bitki hormonları veya bakteri gibi deneysel tedaviler eklenmesi için yüksek çevre denetim sunmuyoruz. Ayrıca dinamik çevre denetim saglayan sırasında yüksek kararlılık düşsel kolaylaştırmak için gelişmekte olan bir çözüm mikrosıvısal platformlar bitki araştırmaları gelişiyle oldu. Bu platformlar tahribatsız büyüme ve yüksek işlem hacmi fenotipleme6,7,8,9, izole kimyasal tedaviler için birkaç bitki türlerinin görselleştirme etkinleştirdikten 10, kuvvet ölçümleri11,12ve mikroorganizmaların13eklenmesi. Mikrosıvısal platformu tasarımlar tek açık alan sıvı katmanlar içinde kökleri, büyüme veya tedavi sırasında içinde ve dışında optik odak kayması için kılı kök erişimine izin verme yaymak kullanımı odaklı olması.
Burada ana root olarak aynı görüntüleme uçağa fide kök tüyleri hapsetmesi tarafından önceki bitki-on-a-chip tasarımlar inşa fotoğraf ve yumuşak Taş baskı yöntemlerini kullanarak bir iki katlı mikrosıvısal platform geliştirmek için bir yordam mevcut. Bu kök saç geliştirme gerçek zamanlı, yüksek çözünürlükte ve deneysel bir tedavi süreci boyunca izlemek için bize izin verir. Bizim kodlamayla yöntemler içinde belgili tanımlık peron ve kültürlü için şırınga pompa ekipman kullanımı gerektirmez sulu ve steril bir ortamda bir haftaya kadar tohumdan germinated Arabidopsis thaliana fidan olanak sağlar. Bir kez sahip olduğu zaman hata görüntüleme deneyi, burada sunulan platformu ince kök özellikleri konumunu bozmadan açılabilir. Bu diğer yüksek çözünürlükte görüntüleme yöntemlerinin kullanımı sağlar. Burada biz temsilcisi sonuçları miktar ve kök saç Morfoloji bu platformda görselleştirme için optik, tarama elektron mikroskobu (SEM) ve Atomik Kuvvet Mikroskobu (AFM) teknikleri sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
İki katmanlı tasarım sınırları tek bir görüntüleme uçağı ve platform için kök tüyleri deconstructed ve yüksek çözünürlüklü olmayan optik görüntüleme için bir substrat kullanılan bir bitki-on-a-chip platformu oluşturmak için bu makalede açıklanan yöntemi benzersizdir . Yüksek çözünürlüklü optik Imaging’i kullanma optik görüntüleme üzerinden tek başına elde edilemedi bitki doku hakkında değerli bilgiler sağlayabilir. Örneğin, AFM görüntüleme geliştirme sırasında veya …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu el yazması UT-Battelle, LLC altında Sözleşme No tarafından kaleme ABD Enerji Bakanlığı ile DE-AC05-00OR22725. Amerika Birleşik Devletleri hükümeti korur ve Yayımcı, yayın, makale kabul ederek Amerika Birleşik Devletleri hükümeti yayımlamak veya yayımlanmış form üretmek için münhasır olmayan, Odenmis, geri alınamaz, dünya çapında lisans korur onaylar Bu makale, veya bunu, Amerika Birleşik Devletleri hükümeti amaçlar için başkalarına izin verme. Enerji Bakanlığı’nın araştırma Federal projeleri DOE kamu erişim planı (http://energy.gov/downloads/doe-public-access-plan) uygun olarak bu sonuçları kamu erişim sağlayacak.
Bu eser kısmen genomik bilim programı, ABD Enerji Bakanlığı, Office bilim, biyolojik ve çevresel araştırma, bitki mikrop arabirimleri bilimsel odak alanını (http://pmi.ornl.gov) bir parçası olarak tarafından desteklenmiştir. Mikrosıvısal platformlar imalatı Nanofabrication araştırma laboratuvarında Merkezi Nanophase malzeme bilimleri için bir DOE ofis, bilim kullanıcı tesis olan gerçekleştirilmiştir. JAA bir NSF yüksek lisans araştırma bursu DGE-1452154 tarafından desteklenmektedir
Materials
| Silicon Wafer | WRS Materials | 100mm diameter, 500-550um thickness, Prime, 10-20 resistivity, N/Phos<100> | |
| Quintel Contact Aligner | Neutronix Quintel Corp | NXQ 7500 Mask Aligner | |
| Fluorescent Microscope | Nikon | Eclipse Ti-U | |
| laboratory tissue | Kimberly Clark | Kimwipe KIMTECH SCIENCE Brand, 34155 | |
| Negative Photoresist Epoxy | Microchem | SU-8 2000s series | |
| Photoresist developer | Microchem | Su-8 developer | |
| trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluoro-octyl)silane | Sigma Aldrich | use in chemical hood | |
| Air Plasma Cleaner | Harrick Plasma | ||
| PDMS | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer base | |
| PDMS curing agent | Dow Corning | Sylgard 184 Silicone elastomer curing agent | |
| Dessicator | Bel-Art | F42010-000 | |
| Scalpel | X-acto knife | ||
| Biopsy Punch | Ted Pella | 15110-15 | |
| Adhesive tape | Staples | Invisible Tape | |
| Microfuge tube | Eppendorf | ||
| Triton X | J.T.Baker XI98-07 | ||
| Bleach | Chlorox | concentrated | |
| Plant-Based Media | Phyto Technology Laboratories | M524 | |
| Agar | Teknova | A7777 | |
| Wax film | Parafilm | ||
| microscope | Olympus | IX51 | |
| Atomic Force Microscope | Keysight Technologies | 5500 PicoPlus AFM | |
| Petri dish | VWR | ||
| Scanning Electron Microscope | JEOL | 7400 | |
| Dual Gun Electron Beam Evaporator | Thermionics | Custom Dual Electron Gun Evaporation System |
References
- Pritchard, S. G. Soil organisms and global climate change. Plant Pathol. 60 (1), 82-99 (2011).
- Norby, R. J., Ledford, J., Reilly, C. D., Miller, N. E., O’Neill, E. G. Fine-root production dominates response of a deciduous forest to atmospheric CO2 enrichment. Proc. Natll. Acad. Sci. USA. 101 (26), 9689-9693 (2004).
- McCormack, M. L., et al. Redefining fine roots improves understanding of below-ground contributions to terrestrial biosphere processes. New Phytol. 207 (3), 505-518 (2015).
- Mangano, S., Juarez, S. P. D., Estevez, J. M. ROS regulation of polar-growth in plant cells. Plant Physiol. 171 (3), 1593-1605 (2016).
- Ketelaar, T., Emons, A. M. The Actin Cytoskeleton in Root Hairs: A Cell Elongation Device. Root Hairs. , 211-232 (2009).
- Grossmann, G., et al. The RootChip: an integrated microfluidic chip for plant science. Plant Cell. 23 (12), 4234-4240 (2011).
- Grossmann, G., et al. Time-lapse fluorescence imaging of Arabidopsis root growth with rapid manipulation of the root environment using the RootChip. J. Vis. Exp. (65), (2012).
- Jiang, H., Xu, Z., Aluru, M. R., Dong, L. Plant chip for high-throughput phenotyping of Arabidopsis. Lab Chip. 14 (7), 1281 (2014).
- Busch, W., et al. A microfluidic device and computational platform for high-throughput live imaging of gene expression. Nat. Methods. 9 (11), (2012).
- Meier, M., Lucchettta, E., Ismagilov, R. Chemical Stimulation of the Arabidopsis thaliana Root using Multi-Laminar Flow on a Microfluidic Chip. Lab Chip. 10 (16), 2147-2153 (2010).
- Ozoe, K., Hida, H., Kanno, I., Higashiyama, T., Notaguchi, M. Early characterization method of plant root adaptability to soil environments. Proc. of 28th IEEE Interntl. Conf. Micro. Electro Mech. Syst. , (2015).
- Sanati Nezhad, A. Microfluidic platforms for plant cells studies. Lab on a chip. , 3262-3274 (2014).
- Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. App. Phys. Lett. 98 (26), 2009-2012 (2011).
- Rigas, S., et al. Root gravitropism and root hair development constitute coupled developmental responses regulated by auxin homeostasis in the Arabidopsis root apex. New Phytolol. 197 (4), 1130-1141 (2013).
- Bengough, A. G., McKenzie, B. M., Hallett, P. D., Valentine, T. A. Root elongation, water stress, and mechanical impedance: A review of limiting stresses and beneficial root tip traits. J. Exp. Bot. 62 (1), 59-68 (2011).
- Sia, S. K., Whitesides, G. M. Microfluidic devices fabricated in poly(dimethylsiloxane) for biological studies. Electrophor. 24 (21), 3563-3576 (2003).
- Millet, L. J., Stewart, M. E., Sweedler, J. V., Nuzzo, R. G., Gillette, M. U. Microfluidic devices for culturing primary mammalian neurons at low densities. Lab chip. 7 (8), 987-994 (2007).
- Nelson, B. K., Cai, X., Nebenführ, A. A multicolored set of in vivo organelle markers for co-localization studies in Arabidopsis and other plants. Plant J. 51 (6), 1126-1136 (2007).
- Talbot, M. J., White, R. G. Cell surface and cell outline imaging in plant tissues using the backscattered electron detector in a variable pressure scanning electron microscope. Plant Methods. 9 (1), 40 (2013).
