Kondrogen pelletsdannelse fra ledningsblod-afledte inducerede pluripotente stamceller

Summary

Her foreslår vi en protokol for chondrogen differentiering fra ledningsblodmononukleære celleafledte humant inducerede pluripotente stamceller.

Abstract

Human ledbrusk mangler evnen til at reparere sig selv. Bruskdegeneration behandles således ikke ved helbredende men ved konservative behandlinger. I øjeblikket bestræbes der på at regenerere beskadiget brusk med ex vivo ekspanderede chondrocytter eller knoglemarvafledte mesenkymale stamceller (BMSC'er). Den begrænsede levedygtighed og ustabilitet af disse celler begrænse deres anvendelse i brusk-rekonstruktion. Humant inducerede pluripotente stamceller (hiPSCs) har modtaget videnskabelig opmærksomhed som et nyt alternativ til regenerative applikationer. Med ubegrænset selvfornyelsesevne og multipotens er hiPSCs blevet fremhævet som en ny erstatningscellekilde til bruskreparation. At opnå en høj mængde chondrogenpellets af høj kvalitet er imidlertid en stor udfordring for deres kliniske anvendelse. I denne undersøgelse anvendte vi embryoidlegeme (EB) -afledte udvækstceller til chondrogen differentiering. Succesfuld chondrogenese blev bekræftet af PCR anD farvning med alcianblåt, toluidinblåt og antistoffer mod henholdsvis kollagentyperne I og II (henholdsvis COL1A1 og COL2A1). Vi tilvejebringer en detaljeret metode til differentiering af blodmononukleære celleafledte iPSC'er (CBMC-hiPSC'er) til chondrogenpellets.

Introduction

Brugen af ​​hiPSC'er repræsenterer en ny strategi for lægemiddel screening og mekanistiske undersøgelser af forskellige sygdomme. Fra et regenerativt perspektiv er hiPSC'er også en potentiel kilde til udskiftning af beskadigede væv, der har begrænset helbredelsesevne, såsom ledbrusk ^{1 , 2} .

Regenerering af indfødt leddbrusk har været en udfordring i flere årtier. Ledbrusk er et blødt, hvidt væv, der strækker slutningen af ​​knoglerne og beskytter dem mod friktion. Det har dog begrænset regenerativ evne, når den er beskadiget, hvilket gør selvreparation næsten umulig. Derfor har forskning fokuseret på bruskregenerering været igangværende i flere årtier.

Tidligere blev in vitro differentiering i den kondrogeniske linie sædvanligvis udført med BMSC'er eller native chondrocytter isoleret fra knæleddet ³ . På grund af tO deres chondrogen potentiale, BMSC'er og native kondrocytter har mange fordele, der støtter deres anvendelse i chondrogenese. På grund af deres begrænsede ekspansion og ustabile fænotype står disse celler imidlertid over for flere begrænsninger ved genopbygningen af ​​leddbruskdefekter. Under in vitro kulturbetingelser har disse celler tendens til at miste deres egen karakteristika efter 3-4 passager, hvilket i sidste ende påvirker deres differentieringsevner ⁴ . Også i tilfælde af native kondrocytter er yderligere skader på knæleddet uundgåeligt, når man opnår disse celler.

I modsætning til BMSC'er eller native kondrocytter kan hiPSC'er uendeligt udvide in vitro . Med de rette kulturbetingelser har hiPSC'er stort potentiale som en erstatningskilde for chondrogen differentiering. Imidlertid er det udfordrende at ændre de høje egenskaber hos hiPSCs ⁵ . Desuden tager det flere komplicerede in vitro stePs til at styre hiPSCs skæbne til en bestemt celletype. På trods af disse komplikationer anbefales brug af hiPSC'er stadig på grund af deres høje selvfornyelsesevner og deres evne til at differentiere til målrettede celler, herunder chondrocytter ⁶ .

Kondrogene differentiering udføres sædvanligvis med tredimensionale dyrkningssystemer, såsom pelletkulturen eller mikromassekulturen ved anvendelse af MSC-lignende stamceller. Hvis du bruger hiPSC'er, adskiller protokollen til at generere MSC-lignende stamceller fra de eksisterende protokoller. Nogle grupper bruger monolagskultur af hiPSC'er til direkte at omdanne fænotypen til MSC-lignende celler ⁷ . De fleste studier bruger dog EB'er til at generere udvækstceller, der ligner MSC ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Forskellige typer vækstfaktorer anvendes til at fremkalde chondrogeNesis. Normalt anvendes BMP- og TGFβ-familieproteiner alene eller i kombination. Differentiering er også blevet induceret med andre faktorer, såsom GDF5, FGF2 og IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . TGFβ1 har vist sig at stimulere chondrogenese på en dosisafhængig måde i MSC'er ¹⁶ . Sammenlignet med den anden isotype, TGFβ3, inducerer TGFβ1 chondrogenese ved at forøge præ-brusk-mesenkymcellekondensationen. TGFβ3 inducerer chondrogenese ved signifikant at forøge mesenchymcelleproliferationen ¹⁷ . Imidlertid anvendes TGFβ3 oftere af forskere end TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 forøger ekspressionen af ​​gener relateret til de chondrogeniske matrixkomponenter i humantArtikulære chondrocytter under in vitro betingelser ²⁰ . BMP2 øger ekspressionen af ​​gener, der er kritiske for bruskdannelse i MSC'er i kombination med TGFβ-proteiner ²¹ . Det har også vist sig, at BMP2 synergistisk forøger effekten af ​​TGFβ3 gennem Smad- og MAPK-banerne ²² .

I denne undersøgelse blev CBMC-hiPSC'er aggregeret i EB'er ved anvendelse af EB-medium i en petriskål med lav vedhæftning. Udvækstceller blev induceret ved at binde EB'erne til en gelatinecoated skål. Kondrogene differentiering ved hjælp af udvækstceller blev udført ved pellets kultur. Behandling med både BMP2 og TGFβ3 kondenserede succesfuldt cellerne og induceret ekstracellulær matrix (ECM) proteinakkumulering til chondrogen pelletsdannelse. Denne undersøgelse antyder en simpel, men effektiv chondrogene differentieringsprotokol ved anvendelse af CBMC-hiPSC'er.

Protocol

Denne protokol blev godkendt af det institutionelle reviewskort i det katolske universitet i Korea (KC12TISI0861). CBMC'er, der blev anvendt til omprogrammering, blev direkte hentet fra Cord Blood Bank i Seoul St. Mary's Hospital. 1. Chondrogen Differentiering fra iPSCs CBMC-iPSC generation Generer CBMC-hiPSC'er ved hjælp af protokollen vist i vores tidligere arbejde 23 . Saml blodcellerne i et 15 ml konisk r…

Representative Results

I dette studie genererede vi chondrogenpellets fra CBMC-hiPSC'er ved at fremkalde udvækstceller fra EB'er. Kondrogene differentiering blev induceret under anvendelse af CBMC-hiPSC'er med bekræftet høj pluripotens 11 . En simpel skema af vores protokol er vist i figur 1A . Før differentiering blev iPSC-kolonier ekspanderet ( figur 1B ). De udvidede iPSC'er blev samlet som EB'er for …

Discussion

Denne protokol genererede succesfulde hiPSC'er fra CBMC'er. Vi omprogrammerede CBMC'er til hiPSC'er ved anvendelse af en Sendai viral vektor indeholdende Yamanaka faktorer ²⁴ . Tre sager blev anvendt i differentiering, og alle forsøg med succes fremkaldte chondrogenpellets ved anvendelse af denne protokol. Talrige undersøgelser har rapporteret protokoller til differentieringen af ​​hiPSC'er i chondrocytter ^{25 , 26</sup…}

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40μg/ml)