Formation de granulés chondrogéniques à partir de cellules souches pluripotentes induites par sang de cordon

Summary

Ici, nous proposons un protocole pour la différenciation chondrogénique des cellules souches pluripotentes induites par les cellules mononucléaires du sang du cordon de l'omble.

Abstract

Le cartilage articulaire humain n'a pas la capacité de se réparer. La dégénérescence du cartilage est donc traitée non par traitement curatif mais par des traitements conservateurs. Actuellement, des efforts sont déployés pour régénérer le cartilage endommagé avec des chondrocytes expansés ex vivo ou des cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BMSC). Cependant, la viabilité et l'instabilité restreintes de ces cellules limitent leur application dans la reconstruction du cartilage. Les cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC) ont reçu l'attention scientifique comme nouvelle alternative pour les applications regénératives. Avec une capacité d'auto-renouvellement illimitée et multipotence, les hiPSC ont été mis en évidence comme une nouvelle source de cellules de remplacement pour la réparation du cartilage. Cependant, l'obtention d'une quantité élevée de granulés chondrogéniques de haute qualité est un défi majeur pour leur application clinique. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules de descendance dérivées du corps embryoïde (EB) pour la différenciation chondrogénique. Une chondrogénèse réussie a été confirmée par PCR etD coloration avec bleu alcian, bleu de toluidine et anticorps contre les collagènes types I et II (COL1A1 et COL2A1, respectivement). Nous fournissons une méthode détaillée pour la différenciation des iPSC à base de cellules mononucléaires du sang du cordon de cordon (CBMC-hiPSC) en pastilles chondrogéniques.

Introduction

L'utilisation de hiPSCs représente une nouvelle stratégie pour le dépistage de drogue et les études mécanistes de diverses maladies. Du point de vue de la régénération, les hiPSC sont également une source potentielle de remplacement des tissus endommagés qui ont une capacité de guérison limitée, comme le cartilage articulaire ^{1 , 2} .

La régénération du cartilage articulaire natif a été un défi depuis plusieurs décennies. Le cartilage articulaire est un tissu doux et blanc qui recouvre la fin des os, les protégeant des frottements. Cependant, il a une capacité de régénération limitée lorsqu'il est endommagé, ce qui rend l'auto-réparation presque impossible. Par conséquent, la recherche axée sur la régénération du cartilage est en cours depuis plusieurs décennies.

Auparavant, la différenciation in vitro dans la lignée chondrogénique était habituellement réalisée avec des BMSC ou des chondrocytes indigènes isolés de l'articulation du genou ³ . Due tO leur potentiel de chondrogenic, BMSC et chondrocytes indigènes ont de nombreux mérites soutenant leur utilisation dans la chondrogénèse. Cependant, en raison de leur expansion limitée et de leur phénotype instable, ces cellules sont confrontées à plusieurs limitations dans la reconstruction des défauts du cartilage articulaire. Dans des conditions de culture in vitro , ces cellules ont tendance à perdre leurs propres caractéristiques après 3 à 4 passages, ce qui finit par affecter leurs capacités de différenciation ⁴ . En outre, dans le cas des chondrocytes indigènes, des dommages supplémentaires à l'articulation du genou sont inévitables lors de l'obtention de ces cellules.

Contrairement aux BMSC ou aux chondrocytes indigènes, les hiPSC peuvent se développer indéfiniment in vitro . Avec les conditions de culture appropriées, les hiPSC ont un grand potentiel en tant que source de remplacement pour la différenciation chondrogénique. Cependant, il est difficile de modifier les caractéristiques intrinsèques des hiPSC ⁵ . En outre, il faut plusieurs essais in vitro compliqués.Ps pour diriger le sort des hiPSC vers un type de cellule spécifique. Malgré ces complications, l'utilisation de hiPSC est toujours recommandée en raison de leur capacité d'auto-renouvellement élevé et de leur capacité à se différencier en cellules ciblées, y compris les chondrocytes ⁶ .

La différenciation chondrogénique est généralement effectuée avec des systèmes de culture tridimensionnels, tels que la culture de pastilles ou la culture de micromasses, en utilisant des cellules progénitrices de type MSC. Si vous utilisez le système HiPSC, le protocole pour générer des cellules progénitrices MSC diffère des protocoles existants. Certains groupes utilisent une culture monocouche de hiPSC pour convertir directement le phénotype en cellules MSC ⁷ . Cependant, la plupart des études utilisent les EB pour générer des cellules secondaires qui ressemblent aux MSC ^{8 , 9 , 10 , 11} .

Différents types de facteurs de croissance sont utilisés pour induire ChondrogeNesis. Habituellement, les protéines de famille BMP et TGFβ sont utilisées, seules ou en combinaison. La différenciation a également été induite avec d'autres facteurs, tels que GDF5, FGF2 et IGF1 ^{12 , 13 , 14 , 15} . On a montré que le TGFß1 stimule la chondrogénèse de manière dose-dépendante dans les MSC ¹⁶ . Par rapport à l'autre isotype, le TGFβ3, le TGFß1 induit une chondrogénèse en augmentant la condensation de la cellule mésenchymateuse pré-cartilagineuse. Le TGFβ3 induit la chondrogénèse en augmentant significativement la prolifération des cellules mésenchymateuses ¹⁷ . Cependant, le TGFβ3 est utilisé plus fréquemment par les chercheurs que TGFβ1 ^{7 , 10 , 18 , 19} . BMP2 améliore l'expression de gènes liés aux composants de la matrice chondrogénique chez l'hommeChondrocytes articulaires dans des conditions in vitro ²⁰ . BMP2 augmente l'expression de gènes critiques pour la formation de cartilage dans les MSC en combinaison avec des protéines TGFβ ²¹ . Il a également été démontré que BMP2 améliore de manière synergique l'effet du TGFβ3 par les voies Smad et MAPK ²² .

Dans cette étude, les CBMC-hiPSC ont été agrégés en EB en utilisant du milieu EB dans une boîte de Petri à faible fixation. Les cellules de dépassement ont été induites en fixant les EB à un plat revêtu de gélatine. La différenciation chondrogénique à l'aide de cellules secondaires a été réalisée par culture de pastilles. Le traitement à la fois avec le BMP2 et le TGFß3 a condensé avec succès les cellules et a induit une accumulation de protéines de la matrice extracellulaire (ECM) pour la formation de granules chondrogéniques. Cette étude suggère un protocole de différenciation chondrogénique simple mais efficace utilisant CBMC-hiPSCs.

Protocol

Ce protocole a été approuvé par le comité d'examen institutionnel de l'Université catholique de Corée (KC12TISI0861). Les CBMC utilisés pour la reprogrammation ont été obtenus directement de la banque de sang de cordon de l'hôpital St. Mary's de Seoul. 1. Différenciation chondrogénique des iPSC Production CBMC-iPSC Générer des CBMC-hiPSC en utilisant le protocole montré dans nos travaux antérieurs 23…

Representative Results

Dans cette étude, nous avons généré des granulés chondrogéniques provenant de CBMC-hiPSC en induisant des cellules secondaires des EB. La différenciation chondrogénique a été induite par CBMC-hiPSC avec une forte pluripotence confirmée 11 . Un schéma simple de notre protocole est illustré à la figure 1A . Avant la différenciation, les colonies iPSC ont été développées ( figure 1B ). Les…

Discussion

Ce protocole a généré avec succès des hiPSC à partir de CBMC. Nous avons reprogrammé les CBMC aux hiPSC en utilisant un vecteur viral Sendai contenant des facteurs Yamanaka ²⁴ . Trois cas ont été utilisés en différenciation, et toutes les expériences ont généré avec succès des granulés chondrogéniques avec ce protocole. De nombreuses études ont rapporté des protocoles pour la différenciation des hiPSC en chondrocytes ^{25 , 26…}

Materials

Plasticware
100mm Dish	TPP	93100
6-well Plate	TPP	92006
50 mL Cornical Tube	SPL	50050
15 mL Cornical Tube	SPL	50015
10 mL Disposable Pipette	Falcon	7551
5 mL Disposable Pipette	Falcon	7543
12-well Plate	TPP	92012
Name	Company	Catalog Number	Description
E8 Medium Materials
DMEM/F12, HEPES	Life Technologies	11330-057	E8 Medium (500 mL)
Sodium Bicarbonate	Life Technologies	25080-094	E8 Medium (Conc.: 543 μg/mL)
Sodium Selenite	Sigma Aldrich	S5261	E8 Medium  (Conc.: 14 ng/mL)
Human Transfferin	Sigma Aldrich	T3705	E8 Medium (Conc.: 10.7 μg/mL)
Basic FGF2	Peprotech	100-18B	E8 Medium  (Conc.: 100 ng/mL)
Human Insulin	Life Technologies	12585-014	E8 Medium (Conc.: 20 μg/mL)
Human TGFβ1	Peprotech	100-21	E8 Medium (Conc.: 2 ng/mL)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	E8 Medium  (Conc.: 64 μg/mL)
DPBS	Life Technologies	14190-144
Vitronectin	Life Technologies	A14700
ROCK Inhibitor	Sigma Aldrich	Y0503
Name	Company	Catalog Number	Description
Quality Control Materials
18 mm Cover Glass	Superior	HSU-0111580
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Triton X-100	BIOSESANG	9002-93-1
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-SSEA4 Antibody	Millipore	MAB4304
Anti-Oct4 Antibody	Santa Cruz	SC9081
Anti-TRA-1-60 Antibody	Millipore	MAB4360
Anti-Sox2 Antibody	Biolegend	630801
Anti-TRA-1-81 Antibody	Millipore	MAB4381
Anti-Klf4 Antibody	Abcam	ab151733
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11029
Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit IgG (H+L) antibody	Molecular Probe	A11037
DAPI	Molecular Probe	D1306
Prolong gold antifade reagent	Invitrogen	P36934
4% Paraformaldyhyde	Tech & Innovation	BPP-9004
Tween 20	BIOSESANG	T1027
Bovine Serum Albumin	Vector Lab	SP-5050
Anti-Collagen II antibody	abcam	ab34712	1:100
Alcian blue	Sigma Aldrich	A3157-10G
Fast Green FCF	Sigma Aldrich	F7252-25G
Safranin O	Sigma Aldrich	090m0039v
Nuclear fast red	Americanmastertech	STNFR100
xylene	Duksan	115
Ethanol	Duksan	64-17-5
Mayer's hematoxylin solution	wako pure chemical industries	LAK7534
DAP	VECTOR LABORATORIES	SK-4100
Slide Glass, Coated	Hyun Il Lab-Mate	HMA-S9914
Trizol	Invitrogen	15596-018
Chloroform	Sigma Aldrich	366919
Isoprypylalcohol	Millipore	109634
Ethanol	Duksan	64-17-5
RevertAid First Strand cDNA Synthesis kit	Thermo Scientfic	K1622
Name	Company	Catalog Number	Description
Chondrogenic Differentiation Materials
DMEM	Life Technologies	11885	Chondrogenic media component (500 mL)
Penicilin Streptomycin	Life Technologies	P4333	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Ascorbic Acid	Sigma Aldrich	A8960	Chondrogenic media component (Conc.: 64 μg/mL)
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)	Life Technologies	11140-050	Chondrogenic media component (Conc.: 100 mM)
rhBMP-2	R&D	355-BM-050	Chondrogenic media component (Conc.:100ng/ml)
Recombinant Hman TGF-beta3	R&D	243-B3-002	Chondrogenic media component (Conc.:10ng/ml)
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
ITS+ Premix	BD	354352	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Dexamethasone-Water Soluble	Sigma Aldrich	D2915-100MG	Chondrogenic media component (Conc.:10-7 M)
GlutaMAX Supplement	Life Technologies	35050-061	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
Sodium pyruvate solution	Sigma Aldrich	S8636	Chondrogenic media component (Conc.: 1 %)
L-Proline	Sigma Aldrich	P5607-25G	Chondrogenic media component (40μg/ml)